大鼠脑出血灶周水肿变化及缺血改变探究

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1、大鼠脑出血灶周水肿变化及缺血改变探究［摘要］目的：通过观察大鼠脑出血模型不同时段的脑含水量，灶周缺血区，凋亡细胞指标的改变，探讨血肿灶周水肿、缺血的变化。方法：自体动脉血注入法制作大鼠脑出血模型，于脑出血(ICIT)损伤后3、5、7、14、21d时间点进行脑含水量测定，2,3,5-氯化三苯基四氮哇(TTC)染色，原位末端标记(TUNEL)法检测凋亡细胞，应用图像处理软件，结合病理组织学改变，比较各个时间点ICH模型血肿灶周水肿与缺血的演变过程。结果：TTC染色，血肿周围色淡染，梗死带内径逐渐扩大，14d后变化最为显著［3d组(0.31±0.06

2、)mm；14d组(2.03±0.13)mm］(P1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物SD雄性大鼠，体重200g左右，由山西医科大学动物实验中心提供。1.1.2试剂2%TTC溶液、TUNEL试剂盒均购于山西省太原市boster试剂公司。1.1.3仪器立体定位仪、必要手术器械；方正V70+扫描仪、计算机设备及软件。1.2动物模型制作大鼠术前8h禁食，不禁水。参照Deinsberger［4］>周中和等［5］的报道方法，采用二次注血/退针法：缓慢注射自体血100卩1至基底节区制成大鼠ICH模型；对照组相同部位打孔进针，不注血。实验阳性大鼠选择参照B

3、ederson等［6］的方法：神经功能缺陷评分22分，及大鼠脑切片中有明显的圆形、椭圆形或不规则的血肿存在为模型成功标准，血液针道反流、进入脑室或死亡者均剔除。1.3试验分组SD大鼠45只，30只造模。按起病后不同时间各分为3、5、7、14、21d5个组，每组各9只（3只对照+6只模型）。1.4脑组织HE染色及TTC染色各组大鼠于ICH损伤后在相应的时间点用过量的水合氯醛麻醉，直接断头取脑，完整取出脑组织，用滤纸吸干脑组织表面的液体和血迹，-2（rc冰箱冷冻20^30min,以进针点所在且垂直于大脑纵裂的冠状面为中心（尽量通过血肿中心）切分脑组

4、织为前后两部分，向前向后取脑冠状脑片各2片，在4片脑片中取包含血肿较小者固定，石蜡包埋，用于HE染色和TUNEL试验；将剩余3片脑片置已预热到37*的2%TTC溶液中，37°C恒温箱内避光染色20min,再浸泡在4%多聚甲醛中固定8〜12h。扫描仪扫描标本切面（光学分辨率和色彩位数分别设置为600dpi,24位真彩色）。观察灶周染色情况；运行图像处理软件运用VisualBasic6.0,打开扫描图像，测量梗死带内径，单位为mm；测量血肿面积，单位为mm2。对照组同时同部位做相同处理。1.5水肿程度评估取1.4中所述模型的剩余脑组织用电子天平先称

5、取湿重，电热恒温培养干燥两用箱10CTC烘烤48h,再称取干重。利用脑组织含水量二（鲜质量-干质量）/鲜质量X100%进行计算。1.6TUNEL法检测凋亡细胞①标本切片常规脱蜡（不过H202）,用蒸馆水洗2次，PBS溶液洗2次，每次5mino②配制新鲜的蛋白酶K（蛋白酶K20ug溶于10mMTris/Hcl中），标本片加新鲜稀释蛋白酶K后37工烤箱中孵育20mino③20min后，取出标本，用PBS洗3次，每次5mino④闭光环境下加TUNEL反应混合物，加完后在烤箱中孵育1h,1h后PBS洗3次，每次5min。⑤避光环境下加POD37°C温箱

6、中孵育30min,后PBS洗3次，每次5mino⑥DAB显色：取1ml蒸馆水，依次加入显色试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后加至标本片上，镜下控制显色时间3〜10min,水洗。⑦苏木素复染、脱水、透明、封片。1.7统计学处理数据以均数土标准差（X土S）表示。运用SPSS17.0软件对数据进行统计学分析，相同时间点手术组与对照组的比较采用两样本t检验；手术组不同时间点的组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1HE染色光镜下可见出血灶与远隔正常脑组织间有一过渡带即血肿周围区。3d时，红细胞溶解，出血灶周炎细胞增多

7、以分叶核中性粒为主，水肿明显，出现少量红色的坏死神经元;5d时出现少量红细胞溶解后的棕黄色颗粒，炎症细胞，细胞水肿程度与3d时相似，能看见少量坏死神经元；7d时依然可见水肿、炎细胞，且水肿细胞间夹杂有核固缩或碎裂的细胞，坏死神经元细胞增加；14d时水肿细胞明显减少，大量坏死细胞及细胞框架，炎细胞及神经元结构不好辨认；21d时血肿吸收者留有中风囊，囊周细胞基本正常。血肿未吸收者周边丧失细胞结构，色淡染，只见不全细胞结构和坏死后的轮廓。2.2TTC染色正常脑片被均匀染成玫红色，灶周区域色淡染，梗死组织呈基本规则的白色带条状，血肿呈灰黑色。梗死带结果

8、见表1,血肿大小变化结果见表2。注：与相同时间点对照组比较，*P本实验对于脑出血水肿高峰期后的病程变化有一个较为直观的阐述，为脑出血的治疗，特别是在脱