TK自杀基因的构建及鉴定

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1、TK自杀基因的构建及鉴定【摘要】目的利用分子生物学技术，构建胸昔激酶基因(TK)自杀基因并测定其结构，为该自杀基因的进一步研究提供良好的实验基础。方法以人类单纯疱疹病毒I(HSV1)基因组DNA为模板，利用聚合酶链反应(PCR)法，扩增出约为1100bpTK基因，定向克隆到载体PEGM-T,构建克隆载体。两端分别引入限制性内切酶NotI、XholI酶切位点，经PCR及酶切鉴定初步证实为重组体后，测序认证。结果经PCR、酶切鉴定和测序鉴定完成TK基因的构建，同源性高达98.70%,完全具备表达该目的基因的

2、要求。结论成功扩增出TK基因，为继续研究打下基础。【关键词】TK基因自杀基因聚合酶链反应Abstract：ObjectiveToconstructthesuicidegeneherpessimplexvirusthymidinekinasegene(HSV-TK)andtosequenceitsstructureforidentification.MethodsTheTKgenefragmentwasamplifiedbyPCRfromthegenomeDNAofherpessimplexvirus・T

3、hePCRproductwasclonedtothevectorPEGM-T.TheinierestedTKgenefragmentintherecombinantplasmidobtainedwasconfirmedbyPCR,enzymedigestionandsequencing.ResultsTheTKgenewassuccessful1yobtained.Theproductwas98.70%original.ConclusionTheconstructionofTKgenemayhelpst

4、arttheresearchintothesuicidegenestrategyforthecontrolofcancers.Keywords:thymidinekinase;suicidegene;polymerasechainreaction(PCR)将某些细菌及病毒中特有的药物敏感基因转导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞产牛某些酶类，将原来无毒或低毒的前体药物代谢转化成细胞毒性产物而杀伤宿主细胞，这种使肿瘤细胞自杀的基因称为“自杀基因”[1]。肿瘤的自杀基因疗法首创于1986年，为目前研究的热点，其中研究最

5、多的当属单纯疱疹病毒胸昔激酶IISV-TK基因。本实验构建了TK基因，以期为进一步研究自杀基因系统的抗肿瘤机制及各种肿瘤基因治疗作用打下基础。1材料和方法1.1材料本实验克隆载体PEGM-T购自Promega公司；病毒株为人类单纯疱疹病毒I(IISV1)作为TK基因模板抽提病毒，购自武汉中国病毒库；大肠杆菌JM109作为宿主菌，由徐州医学院病理学教研室提供。主要试剂盒和实验试剂：PCR扩增试剂盒、DNA胶回收试剂盒、限制性内切酶、T4DNA连接酶为Fennentas公司产品，核酸分子标准品(DL1500

6、Marker)>DNAmarker(Lambda-pUCMixMarker)为Takara公司产品，特异性引物TK基因引物按照《分子克隆实验指南》引物设计原则，并且加入特定的酶切位点，由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物：P15’-TAGCGGCCGCATGGCTTCGTACCCCTGCCATC-3'NotI下游引物：P25’-GCCTCGAGGTTAGCCTCCCCCATCTC-37XholI1.2方法1.2.1IISV1基因组DNA的抽提IISV1加入50mlLB液，250r/min37°C摇菌

7、过夜。上海生工生物工程有限公司基因组DNA分离纯化试剂盒用于提纯基因组DNA(按操作说明书进行)。1.2.2PCR扩增目的基因片段以HSV1基因组DNA为模板进行PCR扩增。50n1PCR反应体系中含HSV1基因组DNA模板3.0u1,dNTP2.0mol/L5u1,MgC121.0mol/L2n1,引物各为5pmol,Tag酶0.5ulo反应参数：94€预变性5min后，94°C变性60s,56°C退火90s,72°C延伸75s,35个循环后，72°C最终延伸20min。1.2.3TK基因的全序列测定

8、取含TK基因片段的PCR扩增产物50UL1%琼脂糖凝胶电泳分离纯化TK基因(1100bp)o取纯化产物3P1加入载体PGEM-T1u1,在T4DNA连接酶作用下，18°C连接过夜，构建PGEM-T-TK重组质粒。取连接产物转化感受态细胞大肠杆菌JM109后，接种Amp抗性、IPTG、x-gal琼脂培养皿，利用蓝白斑菌显色，挑选阳性重组子。取阳性克隆菌落，摇菌过夜，提纯质粒后，分别用T及SP6通用测序引物从两端测定基因全序列(委托上海生工生物