大肠杆菌DH5α菌株pykA基因片段的敲除

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1、学号：201024430127HEBEIUNITEDUNIVERSITY毕业论文GRADUATETHESIS设计题目：大肠杆菌DH5α菌株pykA基因片段的敲除学生姓名：沈广阔专业班级：10生物技术1班学院：冀唐学院指导教师：卢育新李明2014年05月06日摘要摘要目的：将E.coliDH5α菌株的pykA基因敲除，从而降低菌株在作为质粒宿主菌，生产发酵时的产酸量，提高质粒生产效率。方法：(1)将质粒pkD46热激转化至E.coliDH5α菌株内，氨苄青霉素抗性平板培养筛选含有pkD46的E.co

2、liDH5α菌株。(2)以质粒pkD3为模板，PCR扩增两端带有与目的基因上下游同源片段的抗性基因cat。将抗性基因cat电转化E.coliDH5α(含pkD46)菌株，使cat基因替换并敲除pykA基因，氯霉素抗性平板筛选E.coliDH5α(含cat)菌株。（3）将质粒pCP20转入E.coliDH5α(含cat)菌株，在FLP重组酶的作用下，消除cat抗性基因，完成E.coliDH5α菌株的pykA基因敲除。结果：E.coliDH5α菌株的pykA基因成功敲除。关键词：Red重组；基因敲除；

3、pykA基因；E.coliDH5α菌株；FLP重组酶；-20-目录AbstractObjective:ToconstructanE.colistrainDH5αofgenepykA-knockedoutbyusingRedrecombination,whichasthehoststraincouldproducelessacidandraisetheyieldofplasmidDNAafterfermentation.Methods:(1)WetransformedtheplasmidpkD46i

4、ntoE.coliDH5αbyheatshock,thenthepositivestrainswithpkD46wasgottenbyscreeningontheAMP(ampicillin)resistantplate.(2)UsingplasmidpKD3asatemplate，thecat-resistantgeneflankedbyhomologuesofpykAgenewasamplifiedbyPCR．ThePCRproductswereelectro－transformedintoE

5、.coliDH5αstrainwithpKD46.WiththehelpoftheRedrecombinationsystem，pykAgenewasreplacedwiththecat-resistantgene．Thepositivestrainswithwasobtainedbyscreeningonthecat（chloramphenicol）resistantplate.（3）TheplasmidpCP20waselectro－transformedintotheaboveE.coliD

6、H5αstrainwithcat-resistantgene.Thenthecat-resistantgenewaseliminatedbyFLP-promotedrecombinationsystem．Results:ThepykAgeneofE.coliDH5αstrainwascompletelydeleted.Keywords：Redrecombinantsystem;geneknockout;pykAgene；E.coliDH5α;FLPrecombinase;-20-目录目录摘要IAb

7、stractII第1章前言11.1实验背景11.2研究进展11.3实验机理31.4设计思路61.5技术路线7第2章材料与方法82.1材料82.1.1实验材料82.1.2仪器设备82.2方法92.2.1质粒pkD46转化E.coliDH5α92.2.2敲除pykA基因122.2.3质粒pcP20转化E.coliDH5α（含cat）16第3章结果183.1质粒pkD46及酶切凝胶电泳检测结果183.2质粒pkD3凝胶检测结果193.3PCR扩增抗性基因片段，凝胶电泳检测结果203.4PCR扩增抗性基因

8、片段，凝胶电泳检测回收结果203.5PCR验证抗性基因cat替换pykA基因片段结果213.6PCR验证抗性基因消除，cat基因片段敲除结果21讨论22结论23参考文献24谢辞26-20-第1章前言第1章前言1.1实验背景多年以来，细菌质粒DNA作为生物学工具被用于克隆和重组蛋白的表达。近些年，质粒DNA在生物药剂方面的应用备受关注，尤其应用在基因治疗和DNA疫苗方面。质粒DNA作为一种生物制剂很受欢迎，因为他的生产与蛋白、病毒或细胞相比更便捷快速。当前，有少数一些产品在兽医应用方