变形链球菌耐氟菌株eno基因敲除株的构建

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1、分类号：R781.1单位代码：10183C变研究生学号：2015764033密级：公开形链球菌耐氟菌株eno吉林大学基因敲硕士学位论文除株的（专业学位）构建变形链球菌耐氟菌株eno基因敲除株的构建超Theconstructionofenogeneknockoutstrainoffluoride-resistant博strainofStreptococcusmutans吉作者姓名：超博林大类别：口腔医学硕士学领域（方向）：口腔临床医学指导教师：张志民教授培养单位：吉林大学口腔医学院2018年6月变形链球菌耐氟菌株eno基因敲除株的构建Theconstructionofenogen

2、eknockoutstrainoffluoride-resistantStreptococcusmutansstrain作者姓名：超博领域（方向）：口腔临床医学指导教师：张志民教授类别：口腔医学硕士答辩日期：2018年5月23日未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除

3、文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿声明研究生院：本人同意《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》出版章程的内容，愿意将本人的学位论文委托研究生院向中国学术期刊（光盘版）电子杂志社的《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿，希望《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》给予出版，并同意在《中国博硕士学位论文评价数据库》和CNKI系列数据库中使用，同意按章程规定享受相关

4、权益。论文级别：■硕士□博士学科专业：口腔医学论文题目：变形链球菌耐氟菌株eno基因敲除株的构建作者签名：指导教师签名：年月日作者联系地址（邮编）：吉林大学口腔医院牙体牙髓病科130000中文摘要烯醇酶又称磷酸丙酮酸水合酶，在许多有机体中属于高表达蛋白，是糖代谢中的关键酶，催化2-磷酸甘油酸生成磷酸烯醇式丙酮酸。近来研究表明烯醇酶除了具有糖代谢功能之外，在许多生理及病理过程中发挥重要作用。细胞表面的烯醇酶可以与纤溶酶原结合，使纤溶酶原构型改变，从而更易被激活为纤溶酶。纤溶酶是一种血清蛋白，在细菌表面被激活后引发不受控的蛋白水解，降解纤维和组织使感染扩散。福赛斯坦纳菌等牙周病致病

5、菌的烯醇酶对纤维连结蛋白的降解参与了牙周炎中牙龈附着的丧失。此外，烯醇酶表达量及酶活性的升高有助于细菌在含氟环境中生存，降低氟化物的防龋效果。因此，作为一种多功能蛋白，烯醇酶在口腔医学领域的研究中还需要更深入的研究。变形链球菌是龋病的主要病原菌，氟化物是广泛应用的防龋制剂。氟化物的长期大量应用导致了耐氟菌株的选择性生长。变形链球菌耐氟菌株与亲代菌株相比，不仅具有更强的氟耐受能力和致龋能力，同时基因组学及蛋白质组学均有改变。其中eno不仅发生了单个碱基的错义突变（g.1184373bpC>T,p.Thr>Ile）；并且其编码的蛋白表达量上调。说明烯醇酶在变形链球菌耐氟菌株中发挥关

6、键作用。为进一步研究eno基因在变形链球菌耐氟菌株耐氟及致龋中发挥的作用，本实验利用重叠延伸基因拼接技术构建了eno基因插入失活的同源重组DNA线性片段，将抗性筛选基因卡那霉素编码序列插入到eno基因的开放阅读框架中，使细菌无法表达出有功能的烯醇酶从而达到eno基因敲除的目的。并且成功将构建好的同源重组片段与pEASY-Blunt平末端载体连接，以便片段的保存和扩增。通过电转化的方法将扩增并纯化的片段导入变形链球菌耐氟菌株感受态细胞，利用卡那霉素抗性及菌液PCR筛选鉴定出同源重组片段转化成功的变形链球菌耐氟菌株。本实验成功构建了变形链球菌耐氟菌株eno基因敲除株，为明晰eno基

7、因在细菌致病及耐氟等方面发挥的作用及其调控通路，阐明口腔细菌耐受环境压力的机制奠定了基础。eno基因敲除变形链球菌耐氟菌株与未敲除的耐氟菌株之间的表型差异、转录组测序比对、该基因相关的上下游基因表达量的改变等可作为后续的研究方向。关键词：变形链球菌耐氟菌株，eno基因，同源重组，DNA线性片段，基因敲除IAbstractEnolase,knownaspyruvatehydratesynthase,isahighlyexpressedproteininmanyorganisms,andakey