大肠杆菌crispr-cas9系统基因敲除简介

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1、--WORD格式--可编辑--专业资料--1CRISPR-Cas系统的研究进展CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)，即串联的、间隔的短回文重复序列，最早在1987年研究大肠杆菌的碱性磷酸酶基因时被发现[1]。随后在细菌和古细菌的基因组中也发现大量存在CRISPR，研究证实它能够保护自身抵御外来病毒和质粒的入侵[2]，作用机制是依靠crRNA(CRISPRRNA)和tracrRNA(trans-activatingcrRNA)结合并引导Cas蛋白对外源DNA进行特异性降解[3]。已发现的CRISPR-Cas系

2、统有三种类型：Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型，其中以Ⅱ型最为简单，只需一种Cas蛋白，即通过RNA介导核心蛋白Cas9识别并切割靶序列，引起DNA双链断裂[2]。受自然界中CRISPR-Cas系统的启发，主要对来自于化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)的Ⅱ型CRISPR-Cas系统进行人为改造和利用，目前已经将其发展成为一种新型的基因编辑技术，实现基因敲除、插入、定点突变和组合编辑[4]，并成功应用于大肠杆菌、酿酒酵母、家蚕、果蝇和人类细胞等[5]。和传统的基因编辑技术相比，这一新技术具有成本低、操作简便、效率高的优点[6]。2CRISPR-Cas系统的组成与机制典型的Ⅱ型CRIS

3、PR-Cas系统基因座包含tracrRNA基因、Cas蛋白编码基因(cas9、cas1、cas2和csn2)、CRISPR基因座（引导序列、间隔序列和重复序列）这三个部分[6]。Ⅱ型CRISPR-Cas系统的作用机制可分为三个阶段，第一是高度可变间隔序列的获得（图1），第二是CRISPR-Cas系统基因座的表达，第三是对外源遗传物质的降解[6]（图2）。Cas1、Cas2和Csn2蛋白与新间隔序列的获得相关。与间隔序列同源的外源遗传物质上的原间隔序列(protospacer)，其下游存在一段保守序列，被称为PAM(protospaceradjacentmotifs)[7]。当外源噬菌体或质

4、粒首次入侵时，宿主菌通过识别PAM，选取合适的原间隔序列，切割并整合到CRISPR基因座中，形成新的间隔序列。[8]正常情况下CRISPR基因座的表达水平很低，但是当外源噬菌体或质粒再次入侵时，CRISPR基因座的表达水平快速上调，首先转录形成前体crRNA(pre-crRNA)，随后在tracrRNA的指导下，由Cas9和核酸内切酶RNaseⅢ加工为含有一个间隔序列和部分重复序列的成熟crRNA。成熟的crRNA与tracrRNA形成crRNA:tracrRNA复合物，并结合Cas9形成核糖核蛋白复合物，crRNA上的间隔序列与外源DNA的原间隔序列互补配对，从而引导具有核酸内切酶活性的

5、Cas9对DNA双链进行特异性切割。图1宿主菌获得新间隔序列的机制[6]Fig.1NewspcacerofCRISPRacquisition--WORD格式--可编辑---精品资料分享----WORD格式--可编辑--专业资料--图2Ⅱ型CRISPR-Cas系统表达及降解外源遗传物质的机制[6]Fig.2SchematicofCRISPR/Cas9mediatedDNAdouble-strandbreak3双质粒CRISPR-Cas9基因敲除系统本实验中采用双质粒CRISPR-Cas9系统[5]对大肠杆菌进行“无痕”基因敲除，涉及到的两个质粒分别为pCas和pTargetF（图3）。该系统

6、将crRNA:tracrRNA复合物融合为人工设计的sgRNA(singleguideRNA)（图4），省去了将pre-crRNA加工为成熟crRNA的步骤，只需设计长度为20nt，与靶序列互补的N20序列。pCas包含cas9基因及其原始启动子，将Cas9导向pTargetF的pMB1复制子的sgRNA-pMB1，提高编辑效率的λ-Red重组酶基因(gam、bet和exo)，卡那霉素抗性基因kanR和温敏复制子repA101。pTargetF包含sgRNA序列，N20序--WORD格式--可编辑---精品资料分享----WORD格式--可编辑--专业资料--列，pMB1复制子和壮观霉素抗

7、性基因aadA。--WORD格式--可编辑---精品资料分享----WORD格式--可编辑--专业资料--首先向待敲除菌株中电转入pCas，通过L-阿拉伯糖(L-arabinose)诱导，使重组酶Gam、Bet和Exo表达。Gam能与RecBCD核酸外切酶结合，抑制其活性，防止对外源DNA的降解。Exo为核酸外切酶，可以结合在双链DNA末端，从5’向3’降解DNA单链，产生3’突出端。Bet能结合在3’突出端上，保护其