crispr-cas9技术介导阿尔巴斯白绒山羊mstn基因敲除的研究

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2、挙院矿专业＾：动物挙，．＇＇妍究方向；生疆生物学与生物技术＇产古姓名！咕＇．Ｍｔ＇皆Ｖ．是扣诗嚷兵矜指导教师：仓明妍究员的ｆ，一．＂—＂＞．一＾＾２〇巧年５月２０日学校代码１０１２６学号：３１２０８０２４：分类号：编号：论文题目ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技术介导阿尔臣斯白绒山羊ＭＳＴＮ基因敲除的研究ＫＮＯＣＫＯＵＴＭＳＴＮＧＥＮＥＯＦＡＲＥＡＳＣＡＳＨＭＥＲＥ－ＧＯＡＴＢＹＣＲＩＳＰＲＣＡＳ９学院；生命科学学院

3、专业：动物学研巧方向：生殖生物学及生物技术姓名：刘健指导教师：仓明研究员二〇—五年五月原创性声瞩本人齊嚷—；巧狸交的学位论文题本人在辱骑釣錯禪Ｔ謹巧齡礙猜Ｘ律及取得的研巧成果，徐本文ｅ雜注嚷别潔韵离審外，论义中不包渝其他人芭錢发滚或鱗写过館硏究慮繫，也不包當为获得肉靈古大学及－－－興髓教窗机掏荫学位戚证书爾俊觸过：的材料。．聞揽罔Ｘ作韵同惠辯本研ｆｔ所徹的储何巧献均ｅ祕论义中作了題簿的谋明并表示纖激。！嫁嶺肆教靡签名擎佐论文律潜签名：苗：因期－；Ｂ期；２ｍｓ（６

4、７ｆ）．．．．在学期间研究成果使羯承诺书、饿羯学儀论义韵鐵定，即本學檢嫌文作者宛金了解学校巧欢保？：巧讓视大学猶较轉学位论义的愈、，鄉巧容或顯分傑懸并商磯家御关掛鞠娜ｎ邊义学位讓义酌變醇待顯磯纔，允许编入梅关数据雕迸巧赖潔。也巧货累篤藤蠻、鑛巧或；＾撼渡觀手段保齊、沫：编学按论文为銭护学議和导筛的颊识胖巧，作潜在學魏周取簿韵研究康嚴厲子内蒙古大學。作敏今后傻用教及巧攀鑛《主變研究巧容或親充或柴．须粧得的蒙巧乂学纔读婚簡辱师齒同癒若用子发黎论文，《；腹较攀位必缓＊客为离蒙苗大學方可巧鶴或公井发

5、表中．攀俊论；；．後作薇签名进息權＃變鑛變翁兴法＞．資期：，公茲Ｂ織＞£？／一处内蒙古大学硕±学位论文ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技术介导阿尔因斯白绒山羊ＭＳＴＮ基因敲除的研究摘要ｏｓｔａｔｎ－肌肉生长抑制素（Ｍｙｉ，ＭＳＴＮ）又称生长分化因子８ｒｏｗｔｈ（ｇ一ｄ－ｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ８，ＧＤＦ８），是类重要的骨骼ＩＪｌ细胞生长发育的负调控因子，研巧表明，该基因的缺失、突变能加速肌肉生长和改变红白肌的组成比例一－并增加肌肉量。ＣＲＩＳＰＲＣａｓ系

6、统是种来源于细菌获得性免疫的由ＲＮＡ指导Ｃａｓ蛋白对鞭向基因进行－修饰的技术。本研究利用ＣＲＩＳＰＲＣａｓ９系统对阿尔己斯白绒山羊胎儿成纤维细胞和肌肉卫星细胞中的ＭＳＴＮ基因进行了敲除，并通过实时定量ＰＣＲ与Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测了ＭＳＴＮ基因敲除后成纤维细胞中与之相－Ｃａｓ９系统生产基因编辑动物奠定基础关基因的表达情况，为通过ＣＲＩＳＰＲ。１、ＲＮＡ表达载体的设计、构建与转染效率分析ｇ本实验通过麻省理工学院的ＣＲＩＳＰＲＤｅｓｉｇｎ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．Ｍｉｔ．ｅｄｕ）

7、软件ＲＮＡ－设计４对长２０ｉｉｔ的ｇ，ＷＲＮＡＴ２为模板进行ＰＣＲ，扩增得到完整的ＲＮＡｇｇ（最终ＰＣＲ产物长度为４５５ｂｐ）。为了筛选适应于山羊细胞的最优转染条件，本研究利用电穿孔法将红色巧ＭＶ－ＤｓＲｅｄ导入绒山光蛋白表达载体ｐＣ羊胎儿成纤维细胞中，通过流式细胞仪１ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技术介导阿尔己巧白绒山羊ＭＳＴＮ基因敲除的研究刘健６进行分析的结果表明，最优转染条件为；每レ１０个绒山羊胎儿成纤维细胞加入－ＣＭＶ－ＤＲｅｄｓ质粒１０／阵，ＯｔｉＭＥＭ９０，电压２２５Ｖ

8、，脉冲时间２．５ｍｓ。ｐ峭（叫ｇ）ｐ阵利用Ｗ上最佳转染条件将ｈＣａｓ９载体和ｇＲＮＡ共同导入阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞中，培养４化后提取基因组，设计跨打现位点的ＰＣ民引物进斤ＰＣＲ扩増，使用Ｓｕｒｖｅｙｏｒ突变检测试剂盒进行检测，确定有３个ｇＲＮＡ敲除效率较高一，可Ｗ进行下步实验。２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９Ｍ