利用talens技术制备metn基因敲除的阿尔巴斯绒山羊

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1、学校代码：10126分类号：——论文题目学号：三!!Q墨Q三5编号：——利用TALENs技术制备MSTN基因敲除的阿尔巴斯绒山羊GENERATIoNoFMSTNGENEKNoCK．oUTARBASCASHMEREGoATSBYTALENS学院：生命科学学院专业：动物学研究方向：生殖生物学及生物技术姓名：杨文亮指导教师：仓明研究员二。一四年四月原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除本文已经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得凼筮直太坐及其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的

2、同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：毖Et期：2兰2垒．主垫指导教师签名：日在学期间研究成果使用承诺书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古大学有权将学位论文的全部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允许编入有关数据库进行检索，也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权，作者在学期间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古大学就读期间导师的同意；若用于发表论文，版权单位必须署名为内蒙古大学方可

3、投稿或公开发表。学位论文作者签名：扭盖一!指导教师签名：日期：≥。[垒，皇盈日期：内蒙古大学硕士论文利用TALENs技术制备MSTN基因敲除的阿尔巴斯绒山羊摘要肌肉生成抑制素(Myostatin，MSTN)是骨骼肌生长发育的一个重要的负调控因子，是转化生长因子-p(TGF一13)超家族的成员之一，具有抑制肌肉分化和生长的作用。研究表明通过遗传操作降低MSTN基因的表达能加速肌肉生长并增加产肉量。本研究首先构建了针对MSTN基因的TALENs载体，并利用标记蛋白表达载体优化了绒山羊胎儿成纤维细胞的脂质体共转染条件，然后利用最优的转染条件将TALENs载体导入阿尔巴斯白绒山羊胎儿成纤

4、维细胞中，挑取转染后的单个细胞培养，建立单克隆细胞系，通过PCR鉴定筛选出MSTN“和MSTN-／’两种基因型的细胞系。选择MSn一基因型的细胞通过体细胞核移植(Somaticcellnucleartransfer，SCNT)的方法制备胚胎，移植受体后生产基因敲除的绒山羊。l、绒山羊胎儿成纤维细胞共转染条件的优化利用脂质体法将红色荧光蛋白表达载体pCMV-DsRed质粒和绿色荧光蛋白表达载体pEGFP．C1质粒共同导入绒山羊胎儿成纤维细胞中，筛选最优的转染条件。在转染48h后，倒置荧光显微镜下可以观察到大量表达红色荧光和绿色荧光的阳性细胞并且细胞生长状态良好。通过流式细胞仪进行分

5、析，发现最高的共转染率为24．5％。对应的最优共转染条件为：每1x10s个绒山羊胎儿成纤维细胞加入脂质体3pL，pCMV-DsRed和pEGFP-C1的质粒量各250ng。杨文亮乖j用TAILENs技术制备MSTN基因敲除的阿尔巴斯绒山羊2、利用TALENs技术制备MSTN基因敲除绒山羊胎儿成纤维细胞本实验采用“单元组装法”通过酶切连接将四单元模块和三单元模块进行拼接，成功构建出一对TALENs载体。采用最适的转染条件，将TALENs载体bMK(包括S1586-PEAS、S1586-PERR两个质粒)导入阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞中，随机挑取单个细胞培养，建立单克隆细胞系。设计

6、横跨打靶位点的引物对每个单克隆细胞系的基因组进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序，筛选出靶位点发生突变的单克隆细胞系。本研究共进行了三次打靶实验，共获得160个单克隆细胞系，其中有20个单等位基因敲除和3个双等位基因敲除的阳性单克隆细胞系，总敲除效率为14．38％。选取其中一株双等位基因敲除细胞系D4进行染色体数目分析，检测正常率为90％(27／30)。本研究选择D4细胞系作为供体细胞通过体细胞核移植的方法生产MSTN基因敲除绒山羊。3、MSTN基因敲除绒山羊的生产取屠宰山羊卵巢，切割法采卵，体外培养18h，利用盲吸法去除卵母细胞的细胞核，分别将MSTN士型和wT型细胞系作为供

7、体细胞移入去核的卵母细胞中，融合、激活后进行体外发育培养。我们采用电融合法进行融合，融合率分别为74．59％、71．2％：用IA23187和6-DMAP进行融合卵的激活，用发育液进行体外培养，48h后统计卵裂率分别为65。54％、65．9％。本研究通过体细胞核移植技术共获得738枚MSTN乒型重构胚胎和723枚WT型重构胚胎。将其中363枚卵裂的MSn一’克隆胚胎通过手术法移植入自然发情第三天的84只受体母羊的输卵管中。移植2个月后妊娠检测，有7只未返情母羊怀孕，妊娠率为4．76