内蒙古阿尔巴斯绒山羊与蒙古绵羊bmp2部分基因片段的克隆及分析

《内蒙古阿尔巴斯绒山羊与蒙古绵羊bmp2部分基因片段的克隆及分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、内蒙古阿尔巴斯绒山羊与蒙古绵羊BMP2部分基因片段的克隆及分析　　(内蒙古化工职业学院，内蒙古呼和浩特010010) 　　摘要：从阿尔巴斯绒山羊及蒙古绵羊血中提取基因组DNA，根据已报道的BMP2基因的保守序列设计上下游引物，扩增山羊及蒙古绵羊的BMP2基因部分序列，将此片段克隆到pMD18-T载体中，筛选阳性克隆，提取质粒DNA，并进行序列测定，并将两者序列进行比对。结果山羊该核苷酸片段与蒙古绵羊的同源性达99%，另与GenBank中人、小鼠、牛、绵羊的同源性分别为87%，85%，98%和99%。说明该基因在不同物种间具有较高

2、的保守性，尤其是山羊与绵羊之间具有更高的保守性。 　　关键词：骨形态发生蛋白；基因克隆；序列分析 　　中图分类号：S827∶S826.8＋2文献标识码：A文章编号：1007—6921(XX)06—0064—03 　　绒山羊的皮肤和毛囊结构特征不仅是其生物学特征的重要内容，而且对其主要产品—绒毛产量和品质产生直接的重要影响。关于绒山羊绒毛生长机理的研究热点，尹俊、李长青、张燕军等在绒山羊的毛囊发育、生长周期及皮肤基因的表达作了大量的研究〔1～7〕。BMP,即骨形态发生蛋白,是1965年Urist〔8〕对脱钙骨基质的成骨研究

3、中发现的。BMP是一组能在骨骼外异位诱导软骨和骨形成的分泌型蛋白质,其组成不少于20种〔9〕。通过研究发现,BMP家族决定家畜不同时期的生长发育,骨骼形成,并且是毛囊发育涉及的信号分子之一。毛囊形态发生的起始信号源于真皮〔10〕，真皮细胞和上皮细胞之间相互作用，导致两个细胞群体的有序增殖和分化，并最终形成完整的毛囊〔11〕。最近已报道BMP2与小鼠次级毛囊的发生有关。关于绒山羊和蒙古羊毛囊发育与BMP2的关系还未见报道。本实验克隆绒山羊与蒙古羊BMP2基因片段，目的在于研究BMP2基因在绒山羊和绵羊毛囊发育过程中的表达情况，为

4、进一步阐明绒毛生长的机理奠定基础。 1材料与方法 1.1实验材料 　　阿尔巴斯绒山羊血液采自内蒙古阿白羊场，蒙古绵羊血液采自侯先志教授实验牧场。基因组DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、载体pMD18-T、ExtaqDNA聚合酶、IPTG、X-gal、氨苄青霉素、LambderDNA/EcoRI+HindIII、DL100均购于TakaRa公司。其他试剂皆为国产分析纯。 1.2实验方法 　　1.2.1基因组DNA的提取方法。按照TakaRa公司血液基因组DNA提取试剂盒说明书基因组DNA，灭菌三蒸水溶解，-20℃保存。

5、　　1.2.2PCR引物的设计与合成。根据人、鼠、绵羊、牛的BMP2基因的保守序列，设计引物，由大连宝生物基因技术公司合成，引物序列如下： 　　F：5AATAGCAGTTTCCATCACCGAATT3 　　R：5GAGGCGTTTCCGCTGTTTGT3 　　1.2.3PCR扩增条件。PCR反应的总体积为20μl，含1.5mMol/LMg2＋，10×buffer，50ng模板DNA，dNTP的终浓度为75μMol/L，引物终浓度为0.4μMol/L，2.5μTaqDNA聚合酶。PCR扩增条件：94℃5min，94℃1min，5

6、5℃1min，72℃1.5min，循环30次，最后72℃延伸5min。PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。 　　1.2.4PCR产物的克隆。将PCR产物连接到pMD18-T载体，转化已制备好的E.coliDH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素、IPTG、X-gal的LB培养基平版上，37℃温箱培养16～20h。 　　1.2.5阳性克隆的筛选和鉴定。挑取白色单菌落于10ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃,150rpm/min，振荡过夜。取20μl菌液快速筛选阳性克隆〔12〕，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。筛选滞后条带作为重

7、组子，按质粒提取试剂盒操作说明提取质粒DNA，PCR鉴定，条件同上。 1.2.6序列测定与分析。 　　将两个阳性克隆的菌液寄到上海生工生物工程公司进行测序。将获得DNA序列与GenBank数据库中公布的已知功能基因进行序列同源性比较以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。 2结果 　　2.1阿尔巴斯绒山羊基因组DNA及BMP2基因部分外显子的扩增 　　基因组DNA在1.2%的琼脂糖胶中电泳，条带清晰,没有拖尾。经分光光度计测OD260/280的值在1.6～1.8之间。 　　利用人和鼠BMP2基因同源序列设计上下游引物，设计梯

8、度PCR从山羊基因组中扩增出了一条特异条带，测序结果为387bp与预期大小一致。 　　2.2PCR扩增产物与T载体连接及其鉴定 　　PCR扩增产物连到pMD18-T载体上，经转化，利用重组子快速鉴定，筛选滞后重组子并提取质粒DN