crisprcas9技术对绵羊肌肉卫星细胞mstn基因的靶向敲除研究

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1、密级：论文编号:中囯农业科学院学位论文CRISPR7Cas9技术对绵羊肌肉卫星细胞MS77V基因的靶向敲除研究KnockoutofMSTNGenebyCRISPR/Cas9inOvineMuscleSatelliteCells硕士研究生：李聪指导教师：曹文广研究员申请学位类别：农学硕士专业：动物遗传育种与繁殖研究方向：动物基因与细胞工程培养单位：北京畜牧兽医研究所研究生院2015年4月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育

2、机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研宂所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：4"耳时间：砍年6月/曰关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。时间：>0/5年月I曰中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目CRISPR7Cas9技术对绵羊肌肉卫星细胞MS7W基因的敲除研宄动物遗传育种动物基因工

3、程论文作者李聪专业研究方向与繁殖与细胞工程指导教师曹文广研宄员培养单位（研宄所）北京畜牧兽医研宂所姓名职称硕（博）单位专业签名评硕导口中国农业科学院动物遗传苗向阳研宄员博导0北京畜牧兽医研究所育种与繁殖阅硕导口北京农学院人倪和民教授临床兽医学博导0动物科技学院答辩主席硕导口中国农业大学动物遗传朱士恩教授博导0动物科技学院肓种与繁殖硕导口中国农业大学动物遗传刘国世教授博导0动物科技学院育种与繁殖硕导0中国农业科学院动物遗传朱化彬研究员博导H北京畜牧兽医研宄所育种与繁殖.答硕导□中国农业科学院动物遗传育王栋研究员博导a北京畜牧兽医研宄所种与繁殖辩硕导0中国农业科学院动物遗传杜卫华副研宄员博导□北京

4、畜牧兽医研究所育种与繁殖委硕导□博导口员硕导□博导□硕导:博导:会议记录（秘书）mi讀‘t、4论文答辩时间地点2015年5月26日，畜牧所科研楼西会议室Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationKnockoutofMSTNGenebyCRISPR/Cas9inOvineMuscleSatelliteCellsM.S.Candidate：LiCongAdvisor：CaoWenguangMajor：AnimalGenetic,BreedingandReproductionSpecialty：AnimalGenetican

5、dCellEngineeringApril2015摘要CRISPR/Cas9技术是一种新型的基因组靶向修饰技术，可以对生物体基因组特异位点进行定点改造。能够高效的在靶位点产生DNA双链缺口（Double-strandbreaks，DSB）。通过有错误倾向的非同源末端连接（Non-homologousendjoining，NHEJ）机制修复，从而引入插入缺失突变。肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）是一类能够在骨骼肌中特异表达，并对骨骼肌的生长起到负调控作用的糖蛋白，又被称为生长分化因子-8（Growthdifferentiationfactor-8，GDF-8），属于转化生长因子-β

6、（Transforminggrowthfactor-β，TGF-β）超家族。MSTN基因的缺失或突变可引起动物出现“双肌”性状，促进动物肌肉的生长，提高产肉性能。利用CRISPR/Cas9技术制备MSTN基因敲除的绵羊肌卫星细胞，为制备MSTN基因敲除绵羊个体提供了材料。试验设计了4组特异靶向绵羊MSTN基因的靶位点，通过酶切连接的方法插入到CRISPR/Cas9骨架载体中并对其测序验证。通过酶消化法，分离培养了绵羊肌肉卫星细胞，在形态学和分子生物学的角度对其进行验证，并对其脂质体转染条件进行优化。将构建的载体转染到细胞内，通过一代测序和SURVEYOR分析对载体的有效性和敲除效率进行检测。运

7、用极限稀释的方法挑选基因稳定敲除的细胞克隆，再通过TA克隆的方法确定基因突变类型，并对突变后的基因序列进行初步的生物信息学分析。成功构建了4个能够靶向MSTN基因的特定位点的CRISPR/Cas9打靶载体。细胞诱导分化结果表明分离培养的细胞具有融合形成肌管的能力；RT-PCR结果表明肌卫星细胞的特异表达基因MyoG、MyoD、Myf5等在细胞中均有表达，说明分离的细胞确为肌卫星细胞。按照最优转染条