CRISPR_Cas9系统对绵羊MSTN基因编辑的研究.pdf

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1、I分类号：密级：公开学号：2015201605单位代码：10759石河子大学硕士学位论文CRISPR/Cas9系统对绵羊MSTN基因编辑的研究学位申请人魏海霞指导教师周平研究员申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向动物遗传资源利用与分子育种所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2018年6月ResearchofCRISPR/Cas9–mediatedMSTNGeneEditinginSheepADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfort

2、heDegreeofMasterofAgricultureByWeiHai-xia(AnimalGeneticBreedingandReproduction)DissertationSupervisor:Dr.ZhouPingJune,2018本研究受国家转基因重大专项---《高产超细毛转基因羊新品种培育》(NO:2016ZX08008-001)资助。ThisresearchissurpportedbyBreedingofhighyieldandtltra-finewooltransgenicsheep(NO:2016ZX08008-001)I摘要目的：肌肉生长抑制素(Myost

3、atin，MSTN)，又称生长分化因子8(growthdifferentiationfactor8，GDF-8)，是TGF-β超家族成员之一。MSTN是肌细胞生长发育的负调控因子，MSTN基因变异可引起动物的“双肌”性状，从而提高动物的产肉性能。CRISPR/Cas9系统是近几年研究较多的基因编辑工具，其具有构建简单、打靶效率高、使用成本低等优点，可在较短时间内完成各种复杂的基因定点修饰。本研究利用CRISPR/Cas9系统，选择绵羊MSTN基因第三外显子作为靶位点，设计sgRNA和ssDNA，开展绵羊MSTN基因定点编辑研究，为获得MSTN基因定向诱变的转基因肉羊研究工作奠定基

4、础。方法：实验一，采用GibsonAssembly方法将串联表达原件2A和绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)序列插入pX330质粒，构建pX330-EGFP质粒。再将12对sgRNA寡核苷酸链以GoldenGate方法插入pX330-EGFP质粒，构建pX330-EGFP-sgRNA质粒。实验二：利用电转染方法将pX330-EGFP-sgRNA质粒转入绵羊成纤维细胞，48h后收取细胞，利用显微操作系统在倒置荧光显微镜下每组挑取100个表达GFP的细胞。挑选后剩余细胞提取基因组后进行PCR，PCR产物纯化后通过SURVEYOR分

5、析，初步检测sgRNA目标靶点DNA是否发生突变。然后提取具有靶向效果组的100个携带GFP细胞的基因组进行PCR，将PCR产物纯化后T-A克隆，每组随机挑选10个单克隆测序，统计基因突变效率。实验三：将筛选出的高效打靶sgRNA与Cas9蛋白以三种不同浓度混合后，通过显微注射系统注入孤雌激活的绵羊成熟卵母细胞，72h后挑取正常发育的桑椹胚，提取基因组用于PCR，将纯化的PCR产物经T-A克隆后测序。根据测序结果统计每组的基因突变效率，得出最优的注射浓度。实验四：设计并合成120bp的ssDNA，其序列相比绵羊MSTN第三外显子基因序列缺失11碱基并引入一个XbaI酶切位点。CR

6、ISPR/Cas9系统以ssDNA为外源同源序列介导sgRNA打靶位点的同源指导修复。实验分为试验组与对照组，试验组通过显微注射系统向孤雌激活的绵羊卵母细胞注入最佳浓度的sgRNA，Cas9蛋白及ssDNA，仅注射ssDNA的受精卵作为对照组。受精卵在体外发育72h后将其裂解提取基因组进行PCR，将PCR产物T-A克隆到载体测序，分析测序结果，判断绵羊MSTN基因第三外显子是否发生目标位点定点编辑并统计编辑效率。结果：实验一，pX330-EGFP及pX330-EGFP-sgRNA质粒酶切后，经琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小分别为9261bp，9281bp，测序结果表明两种质粒被成功

7、构建。实验二，利用电转染的方式将pX330-EGFP-sgRNA转入绵羊成纤维细胞，经SURVEYOR法分析和测序，成功筛选出三个靶向效率较高的sgRNA(T2，T9，Q2)，效5率分别为40%，40%，60%。同时将电转条件优化为20µL电转液悬浮2×10数量的细I胞，用于转染的pX330-EGFP-sgRNA质粒的量为4µg。实验三，结果显示sgRNA及Cas9蛋白浓度分别为200ng/µL及1000ng/µL时，注入孤雌激活的卵母细胞造成绵羊MSTN基因突变效率最高，为70