一株产黑色素海洋细菌的初步鉴定

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1、一株产黑色素海洋细菌的初步鉴定一株产黑色素海洋细菌的初步鉴定摘耍：从波罗的海近海海水中分离出1株产黑色素的海洋细菌。该菌株可利用麦芽糖、蔗糖、葡萄糖等碳源，H2S、V.P.及明胶液化试验呈阴性，酶触试验呈阳性，为革兰氏阴性细菌，经16SrDNA初步鉴定后命名为Rheinheimerasp.09BSZB-9,并对其产生的黑色素作了初步研究。关键词：海洋细菌；黑色素；鉴定；Rheinheimera中图分类号:Q93-3文献标识码:A文章编号：0439-8114(2013)13-3046-03黑色素广泛存在

2、于自然界生物体内，是一类由L-多巴、酪氨酸和半胱氨酸氧化或聚合而成的天然或合成色索［1］。它是医药、农业及化妆品行业的一种生产原料。从动植物体内提取黑色素的生产过程繁琐、成本高，而微生物所产的黑色索一般是rti胞内酶催化形成的氨基酸的衍生物。产黑色素的微生物资源丰富，生产工艺简单易行，产品无毒害，稳定性好。因此研究微生物发酵产生黑色素具有很大的优势［2-4］o人们对陆境产黑色索的微生物研究较多，对海洋中产黑色索的微生物报道较少。本试验研究从波罗的海分离的一株着色菌科细菌，该菌具有产黑色素的能力，在生理

3、生化特征及16SrDNA序列等方面与Rheinheimerachironomi相近，以期为海洋微生物黑色索研发提供理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种来源菌株ZB-9市本实验室的刘斌分离于波罗的海(E12.6875°,N54.4298°)海水。1.1.2主要试剂和仪器DNAMarker、dNTPs、Taq酶等购自Takara公司；PCR纯化试剂盒购自Omega公司；Biometre公司PCR扩增仪(T3)；Eppendorf公司微型台式离心机；日本JEOL公司JEM-1230透射式电镜；徳国

4、Bruker公司TENSOR27型红外光谱仪。1.1.3培养基2216E细菌培养基、Tyr发酵培养基［5］、酪素培养基［6］、LB培养基均按人工海水和蒸憾水各半配制，121°C灭菌30mino1.2方法1.2.1生理生化指标的测定参照文献［7、8］对菌株ZB-9进行生理生化实验测定。1.2.2形态特征观察及发酵将菌株ZB-9接种于LB培养基，24°C培养2d,利用显微镜及透射电镜观察菌体形态并拍照。将菌株涂布于2216E平板，24°C活化2d,转接试管培养2d,再将菌液接种于1.1.3的4种液体培养基

5、中，24°C,150r/min摇瓶培养至菌液呈黑色。1.2.316SrDNA序列分析细菌基因组DNA的提取参照文献［9］的方法。PCR扩增的通用引物：27F,1492R；PCR反应条件：95°C5min,94°C40s,56°C40s,72°C2min,30个循环；72°C10minoPCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，试剂盒纯化后，送交上海博亚生物技术有限公司完成序列测定。所测得的序列提交至GenBank,获得登录号，并与数据库EzTaxonServerVersion2.1中已有序列进行BLAST

6、比对分析，选取同源性较高的16SrDNA序列作为参比对象，运用DNAMAN进彳亍多重序列分析，通过MEGA4.0软件,采用邻接法构建系统进化树［10］。1.2.4黑色素的提取与鉴定参照文献［11、12］方法提取黑色素;取少量提取的黑色素纯品，用漠化钾压片法测其红外吸收光谱。2结果与分析2.1菌株的生理生化特征挑新鲜菌落于3%的K0H中出现拉丝现象，为革兰氏阴性菌,H2S、JiffV.P.及明胶液化试验呈阴性，酶触试验呈阳性，铜离子（0.1g/L）会抑制其纶长。对麦芽糖、蔗糖及纤维二糖利用较好，不能利用

7、淀粉、柠檬酸（表1）。菌株在酪氨酸培养基上适宜生长温度为4〜40°C。菌落较小，湿润、光滑、圆形突起、边缘整齐，菌体Z间粘连成团,易挑取整个菌落，呈黑色（起初白色，产黑色素后呈黑色，图1）。2.2菌株的形态及发酵特性菌体宽0.8〜1.4um,长0.8〜2.4um,电镜下菌体周围有分泌物，单端鞭毛（图2）。菌株在4种液体培养基中均产生黑色素，其中较好的是Tyr发酵培养基。2.3菌株的鉴定结果该菌株的16SrDNA序列长度为1358bp,GenBank登录号为IIM566014o将该序列与数据库EzTax

8、onServerVersion2.1相关序列进行BLAST分析，选取同源性高的9株菌的16SrDNA序列构建系统发育树，如图3所示，该菌株与R.chironomi处于进化树的同一分支，同源性99.853%,与R・pacifica的同源性97.035%。除产黑色素同R・chironomi有别外，其他生理生化及形态特征差别不大。2.4黑色素的鉴定结果红外光谱分析表明，样品在3300-3400cm-l>1640cm-1附近有强吸收峰，在1382cm-1、145