RNA_干扰研究进展

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1、RNAi技术研究进展RNA干tfcfRNAinterference,RNAi)现彖是一种进化上保守的抵御转基因或外來病毒侵犯的防御机制，是指内源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(double—strandedRNA,dsRNA),在细胞内特异地降解该mRNA,从而致使特异性的基因有效封闭的过程，是一种序列特异性的转录后基因沉默(post〜transcriptionalgenesilencing,PTGS)oRNAi现象已在不同种属的牛物体中发现，并在牛物体细胞Z间

2、进行传递，具有抵抗病毒入侵和维持基因组稳定的作用，RNAi技术不仅能大大推进人类后基凶组计划的发展，述能高通量地筛选勿物靶基因，促进基因治疗、新药开发等，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟新的途径。RNAi的机理与特点生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染、转座子的转录产物、外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制,结果是病毒被淸除，转座子的表达被阻断，外源导人基因表达被阻断的同时，与其同源的细胞基因纽中的基因农达也被阻断。1.RNAi发生的分子机制：RNAi的详细机制和过程

3、还不I-分清楚，目前人致分为以下儿个阶段进行：(l)siRNA的形成阶段：此阶段需要Rde一2、Rde-4和dsRNA特异性的核酸内切酶Dicer等共同参与。Rde-1,4编码的蛋白识别并引导dsRNA与Dieer结合,然后Dicer将dsRNA解旋，再将其裂解为21〜25nt大小的小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)。Dicer定位于胞浆中，但核内mRNA剪切修饰后，向核外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为21〜25nt大小在3,

4、端带有2〜3个碱棊悬端和宁端磷酸化的siRNA诱导的RNAi效应最强。Dicer家族在进化上非常保守,有5个组成部分,即N端RNA解旋酶结构域、1个PAZ结构域(Piwi,augonaute,Zwille/pinehead,PAZ)>2个RNaseHI结构域和C端dsRNA结合基序。Dicer在体内一般以二聚体的形式发挥作用，由于不同种族Dicer分子大小不一样，所以dsRNA被切割成的siRNA大小具有种族差异性③。(2JRNA诱导的沉默复合物(RNA—inducedsillencingcom

5、plex,RISC)形成阶段:生成的siRNA和RNAi特异，性酶，如AGO—2、MUT—7、RED——1、PAZ蛋口和DNA——RNA螺旋酶结合形成RISC,具有序列特异性核酸内、外切酶和解旋酶活性，能特异地降解与siRNA同源的靶mRNA。⑶效应阶段④:siRNA弓

6、导RISC与同源性的mRNA结合，在ATP及解旋酶(如Rde—3、MUT-6、MUT—14)的作用下使siRNA链解离，并使RISC山250X1()3。大小的前体形式变成约100X103o在右活性形式，同时解旋酶催化同源mRNA

7、与siRNA的正义链互换，核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5,起始端下游7〜10个核昔酸处切断mRNA,起到特异地抑制基因表达的效果。(4)扩增阶段：该反应以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA为模板，在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA—dependentRNApolymerase,RdRP)作用下，扩增靶mRNA,产牛新的二级siRNA,而这些siRNA乂能继续反作用于靶mRNA。RdRP不仅能加siRNA的拷贝数，而且能将异常的单链RNA转变为dsRNAoRdRP还是一个重要

8、的“感应器”，它能识别正常和异常的RNAo转基因RNA和病毒RNA都在RdRP的识别下启动RNAi的反应过程。此外，RNAi的扩增效应述可能存在另外两种机制：(1)Dicer将长dsRNA切成初级siRNA,这一放大水平取决于dsRNA的长度(2)siRNA在酶的作用下可以多次应用，产生进一步的放大效应。2.RNAi的特点：⑴高度特异性：有时siRNA一个碱基改变就会人大降低封闭靶基因的效果。Brummelkamp等⑤利用载体农达的小发夹RNA(smallhairpinRNA,shRNA)來封闭

9、人MCF-7细胞的CDHI基因,shRNA±仅一对碱基的突变就不能抑制CDHI基因的表达。其中,siRNA的中央位置基位点和3,末端倒数第2个碱基起了特别重要的作用。(2)高效率③：在细胞内RNAi途径一旦被启动，反应信号就被放大。在低等动物中靶基因表达抑制效率大于90,其至有人认为每个细胞一份拷贝的dsRNA就口J以达到封闭基因的效杲。⑶爲成功率:RNAi已被用于线虫全基因组的功能分析,其中有50〜80序列选择有效，12.9%〜27%的基因封闭产牛了明显的异常表型。(4)种属时效性：Irie等