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1、RNA干扰研究进展谢克亮】王世平
2、赵长安2(1新乡医学院本科2001级一部，2新乡医学院牛物化学教研室河南新乡453003)RNA干扰(RNAinterference,RNAi)现彖是一种进化上保守的抵御转基因或外來病毒侵犯的防御机制，是指內源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(double-strandedRNA,dsRXA)在细胞内特界地降解该mRNA,从而致使特界性的基因有效封闭的过程,是一种序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilenci
3、ng,PTGS)oRNAi现象已在不同种属的生物体中发现,下面对RNAi的作用机制、作用特点、生物学意义和应用等的授新研究进展作一综述。1.RNAi的作用机制与特点1.1RNAi发生的分子机制RXAi的详细机制和过程还不十分清楚，目前大致分为以下儿个阶段进行：①siRA的形成阶段：此阶段需要Rde-l,Rde-4和dsRNA特异性的核酸内切酶Dicer等共同参与。Rde-1,4编码的蛋白识别外源dsRNA,引导dsRNA与Dicer结合,然后,Dicer将dsRNA解旋，再将其裂解为21-25nt大小的小干扰RNA
4、(smallinterferingRNA,siRNA)oDicer定位于胞浆中，但核内mRNA剪切修饰后在向核外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为21-25nt人小并在3,端带有2-3个碱基悬端且5’端磷酸化的siRNA诱导的RNAi效应最强。Dicer家族在进化上非常保守，有5个组成部分：N-端RNA解旋酶结构域、1个PAZ结构域(Piwi,augonaute,Zwille/pinehead,PAZ)>2个RNase!TT结构域和C端dsRNA结合基序。Dicer在体内一般是以二聚
5、体的形式发挥作用的，由于不同种族Dicer分子大小不一样,所以dsRNA被切割成的siRNA大小具有种族差异⑴。②RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilicencingcomplex,RISC)形成阶段：生成的siRNA和RNAi特异性酶如AGO-2、MUT-7、RED-l、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶结合形成RISC,具冇序列特界性核酸内切酶、核酸外切酶和解旋酶活性，能特界地降解打siRNA同源的靶mRNA。③效应阶段汽siRNA引导RISC与同源性的mRNA结合，在ATP及解旋酣(如qde-3,
6、mut-6,mut-14)的作用下使siRNA链解离，并使RISC由250kD大小的前体形式变成约lOOkD左右活性形式，同时解旋酶催化同源mRNA与siRXA的正义链相互交换，核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5'起始端下游7-10个核廿酸处切断mRNA,起到特异的抑制基因表达的效果。④扩增阶段：该反应以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA为摸板，在RNA依赖的RNA聚合0®(RNA-dependentRXApolymerase,RdRP)作用卜，扩增靶mRNA,产生新的二级siRNA,而这些siRN
7、A又能继续反作用于靶mRNA。RdRP不仅能增加siRNA的拷贝数，而且能将异常的单链RNA转变dsRNAoRdRP还是一个重要的“sensor",它能识别正常和异常的RNAo转基因RNA和病毒RNA都是在RdRP的识别下启动RNAi的反应过程⑶。此外，RNAi的扩增效应还町能存在另外两种机制：①Dicer将长dsRNA切成初级siRNA,这一放人水平取决于dsRNA的长度；②siRNA在酣的作用F可以多次应用，产生进一步的放大效应。1.2RNAi的特点①高度特异性：有时siRNA一个碱基改变就会人大降低封闭靶基因的
8、效果。Brummelkamp"等利用载体表达的小发夹RNA(smallhairpinRNA,shRNA)来封闭人MCF-7细胞的CDII1基因，shRNA上仅一对碱基的突变就不能抑制CDH1基因的表达。其屮siRNA的中央位置碱基位点和3,末端倒数笫二个碱基起了格外重耍的作用。②高效率⑴：在细胞内RNAi途径一旦被卅动，反应信号就被放大。在低等动物中靶基因表达抑制效率大于90%,甚至有人认为每个细胞一份拷贝的dsRA就可以封闭基因的效果。③高成功率：RNAi己被用于线虫全基因组的功能分析，其屮有50%-80%序列选
9、择有效，12.9%-27%的基因封闭产生了明显的片常表型。④种属时-效性：Irie⑸等人发现，在低等生物中RNAi可持续存在，但RNAi在哺乳动物细胞中只能维持一段时间，一般注入dsRXA后的2-3天，RNAi的作川最明显，尔后1-2犬内，靶mRNA的丰度就能恢复到注射RNAi之前的水平。这町能是由于RNA依赖的核昔脱氨酶脱氨基活性的逐步增高导
