苦玄参褐斑病病原鉴定及致病因素分析

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1、苦玄参褐斑病病原鉴定及致病因素分析摘要:为明确近年来引起广西梧州地区苦玄参(PicriafelterraeLour.)褐斑病的病原菌种类及致病因素，依据柯赫氏法则进行了致病性测定和病原菌验证，通过形态学观察、rDNA-ITS序列分析确定病原菌；通过对不同光照条件下病情调查，分析光照对该病害发生的影响。结果表明,病原菌形态特征与［Alternariaporri(ELL.)Ciferri］一致，其rDNATTS序列与GenBank41［Alternariaporri(ELL.)Ciferri］相似性达99%；强光利于病原菌菌丝生长、抱子产生及萌发。可

2、见梧州地区苦玄参褐斑病病原菌为葱链格菌［Alternariaporri(ELL.)Ciferri］；光照是诱发苦玄参褐斑病的主要致病因素。关键词：苦玄参；褐斑病；病原鉴定；致病因素中图分类号：S482.1文献标识码：A文章编号：0439-8114(2013)16-3836-03苦玄参(PicriafelterraeLour.)又名苦草、鱼胆草、四环素草、蛇总管，为玄参科苦玄参属植物，以全草入药，是《中华人民共和国药典》收载品种［1］,主要分布于广西、广东及云南等地，在广西民间作药用已有200多年的历史［2］。苦玄参作为广西大宗、道地药材，是广西梧

3、州制药(集团)股份有限公司生产的妇炎净胶囊的主要原料药材，也是广西多家制笏企业生产的炎肿化毒片、炎见宁片、万通炎康片、维威消炎灵等多种中成药的原料药材[3]0随着医夯市场需求的逐年增加，苦玄参在广西梧州地区广泛栽培。调查发现，近年来苦玄参褐斑病在梧州各栽培区普遍发生，造成叶斑、叶片枯黄，严重者叶片全部卷缩，植株枯死。国内外关于苦玄参病害的研究尚未见报道，褐斑病为首次报道的苦玄参病害。明确苦玄参褐斑病病原菌对于该病害的预防与控制具有重要意义。环境因素对病害的发生流行起着重要作用，就光照与苦玄参褐斑病的关系进行探讨，可以阐明光照在该病害的发生中的作用

4、，以指导生产。1材料和方法1.1病菌釆样与分离、纯化苦玄参褐斑病典型病叶采自广西梧州市岭角镇武烈村。病原菌的分离及纯化参照文献[4]o采集的病叶用清水洗净，剪取病叶组织（边长4〜5mm的正方形）,用75%的乙醇消毒2~3s,0.1%氯化汞消毒2min,无菌水冲洗3遍，置于灭菌滤纸上吸干水，将病叶组织接种在马铃薯葡萄糖（PDA）琼脂培养基上，26°C恒温培养4d,对分离物归类、编号。纯化培养采用单抱分离法纯化产也真菌，采用多次挑取菌落边缘菌丝转皿纯化不产孑包真菌，纯化后的真菌转管保存。1.2致病性测定[4]将纯化菌株接种至PDA琼脂培养基，在28°

5、C、相对湿度65%霉菌培养箱内培养5d,用打孔器制备直径9mm的菌饼。用无菌接种针在健康的离体苦玄参叶片上刺成面积约为1cm2的伤口，用接种铲将菌饼接至伤口，保湿培养3〜4d,观察发病情况。根据柯赫氏法则，对发病叶片病菌进行再分离，显微镜下观察分离得到的病菌足否与原接种菌株相同。以接种PDA培养基作为对照，在室温（20〜25°C）下保湿培养5d,记录发病情况。1.3形态学鉴定将致病菌株移至PDA平板上28°C下培养，玻片培养法观察，记载病原菌的形态特征，以病原菌菌落形态、病害症状为依据鉴定病原菌种属⑷。1.4核糖体rDNA-ITS序列分析采用SD

6、S法提取病原菌株的基因组DNA［5］o采用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物1TS4（5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和1TS5（5‘-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）（上海捷瑞生物工程有限公司合成）扩增该菌的rDNA-ITS序列。扩增产物的纯化和测序委托北京诺赛基因组研究中心有限公司完成，将得到的序列在GenBank中进行同源性比较［6］。1.5光照对病害的影响选择除光照条件不同外，土壤、栽培管理等其他条件均一致的栽培地,采用IJ-1400型便携式光量子辐射计分别测定各栽培地的光照强度。对不同光

7、照条件下的苦玄参进行发病情况调查，每地块随机调查5个点，每个点查20株，每株调查10张叶片，调查叶片病级情况（分级标准见表1）,统计发病株数及病情指数［7］。病情指数二（各级病级代表值X该病级病叶数）/（调查叶片数X发病最重级代表值）XIOOo2结果和分析1.1病害症状苦玄参褐斑病在广西梧州始于5月初，苗期可见症状发生，但为害不严重。6月下旬至8月是苦玄参的田间生长旺期，也是病害发生高峰期。多从靠近心叶的2〜3片叶片开始发病，受害叶片初期病部呈水渍状淡黄小点，病斑不断扩大，形成不规则黄褐色斑块，大小为0.2-0.4cmXO.5~0.8cm,病健交

8、界处为紫褐色（图la）o天气或环境潮湿时，病叶呈水渍状；天气或环境干燥时病斑穿孔。后期病斑连片，病叶卷缩，呈火烧状。1.2病原菌鉴定2.