【农林学类论文】苦玄参褐斑病病原鉴定及致病因素的严重程度分析

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1、苦玄参褐斑病病原鉴定及致病因索的严巫程度分析苦玄参（PicriafelterraeLour.）乂名苦草、血胆.草、四环素草、蛇总管，为玄参科苦玄参属植物，以全草入药，是《中华人民共和国药典》收载品种［1］,主耍分布于广西、广东及云南等地，在广西民间作药用已有20（）多年的历史［2］。苦玄参作为广西大宗、道地药材，是广西梧州制药（集团）股份有限公司生产的妇炎净胶囊的主要原料药材，也是广西多家制费企业生产的炎肿化毒片、炎见宁片、万通炎康片、维威消炎灵等多种屮成药的原料药材［3］。随着医药市场需求的逐年增加，苦玄参在广西梧州地区广泛栽培。调查发现，近年来

2、苦玄参褐斑病在梧州各栽培区普遍发牛:，造成叶斑、叶片枯黄，严重者叶片全部卷缩，植株枯死。国内外关于苦玄参病害的研究尚未见报道，褐斑病为首次报道的苦玄参病害。明确苦玄参褐斑病病原菌对于该病害的预防与控制具有重要意义。环境因素对病害的发生流行起着重要作用，就光照与苦玄参褐斑病的关系进行探讨，可以阐明光照在该病害的发牛小的作用，以指导牛产。1材料和方法1」病菌采样与分离、纯化苦玄参褐斑病典型病叶采口广西梧州市岭角镇武烈村。病原菌的分离及纯化参照文献I4jo采集的病叶用清水洗净，剪取病叶组织（边长4〜5mm的止方形），用75%的乙醇消毒2〜3s,0.1%氯

3、化汞消毒2min,无菌水冲洗3遍，迸于灭菌滤纸上吸干水，将病叶组织接种在马铃薯葡萄糖（PDA）琼脂培养基上，26°C恒温培养4d,对分离物归类、编号。纯化培养采用单砲分离法纯化产砲真菌，采用多次挑取菌落边缘菌丝转皿纯化不产砲真菌，纯化后的真菌转管保存。思想汇报/sixianghuibao/1.2致病性测定［4］将纯化菌株接种至PDA琼脂培养革，在28°C、相对湿度65%霉菌培养箱内培养5d,用打孔器制备肓径9mm的菌饼。用无菌接种针在健康的离体苦玄参叶片上刺成面积约为1cm2的伤口，用接种铲将菌饼接至伤口，保湿培养3〜4d,观察发病情况。根据柯赫氏

4、法则,对发病叶片病菌进行再分离，显微镜下观察分离得到的病菌是否与原接种菌株相同。以接种PDA培养基作为对照，在室温（2（）〜25°C）下保湿培养5d,记录发病情况。1.3形态学鉴定将致病菌株移至PDA平板上28°C下培养，玻片培养法观察，记载病原菌的形态特征,以病原菌菌落形态、病害症状为依据鉴定病原菌种属[4]。1.4核糖体rDNA-ITS序列分析采用SDS法提取病原菌株的基因mDNA[5]o采用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5&prim

5、e;-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）（上海捷瑞生物工程有限公司合成）扩增该菌的rDNA-ITS序列。扩增产物的纯化和测序委托北京诺赛基因组研究中心冇限公司完成，将得到的序列在GenBank中进行同源性比较⑹。1.5光照对病害的影响选择除光照条件不同外，土壤、栽培管理等其他条件均一致的栽培地，采用LI-1400型便携式光量子辐射计分别测定各栽培地的光照强度。对不同光照条件卜•的苦玄参进行发病惜况调杏，每地块随机调杳5个点，每个点杳2（）株，每株调杳1（）张叶片，调杏叶片病级情况（分级标准见表1）,统计发病株数及病情指

6、数⑺。开题报告/html/lunwcnzhidao/kaitibaogao/病情指数二（各级病级代表值×该病级病叶数）/（调查叶片数×发病最重级代表值）×100o2结果和分析2」病害症状苦玄参褐斑病在广西梧州始于5刀初，苗期可见症状发生，但为害不严重。6刀下旬至8月是苦玄参的田间生长旺期，也是病害发生高峰期。多从靠近心叶的2〜3片叶片开始发病，受害叶片初期病部呈水渍状淡黄小点，病斑不断扩大，形成不规则黄褐色斑块，大小为0.2~0.4cm&（imes;（）.5~0.8cm,病健交界处为紫褐色（图la）。天气或环境潮

7、湿时，病叶呈水渍状；天气或环境干燥时病斑穿孔。示期病斑连片，病叶卷缩，呈火烧状。2.2病原菌鉴定221病原菌分离、纯化患褐斑病苦玄参组织26°C恒温培养3〜4d后长岀菌落，共分离到5株真菌菌株。2.2.2致病性测定将分离所得的5株菌株室内接种至健康的离体苦玄参叶片上保湿培养5d,仅K-l・2菌株接种的发病（图la）,其他未发病。发病叶片表现出明显的褐色水渍状斑点，对病叶进行病菌再分离接种，获得与原分离菌株一致的菌株。根据柯赫氏法则，确定试验中分离的K-1-2菌株为苦玄参褐斑病的病原菌。2.2.3病原菌的形态特征菌株K-1-2在PDA琼脂培养基上的菌

8、落呈圆形，有同心轮纹（图lb）,初期菌丝白色，6〜7d后呈灰片色，菌丝颜色逐渐加深，从平皿背面观察到培养基的颜色逐渐加深至