细胞培养总结

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1、细胞培养学习总结■•贴壁细胞培养技术一、细胞培养一般流程：㈠、复苏：1、实验前做好相关准备工作（水浴锅37°C；超净工作台的无菌环境；准备好实验相关仪器和试剂）。2、把冻存管从液氮灌小取出来，立即投入37°C（W40°C）水浴锅屮，晃动冻存管，使液体在lmin以内全部融解（关键步骤），用酒精棉擦拭其外壁，放到超净工作台里。3、把上述细胞悬液吸到15ml的离心管中，加入适量培养基，（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下來，转移时不要直接倒，以防污染），1000转离心l・3min（可根据所培养细胞调整）。4、吸弃上清液，加适量培

2、养基把细胞吹散成细胞悬液，转移到培养瓶中，加适量完全培养基（常为覆盖培养瓶底而即可）。5、标好细胞种类和口期、培养人名字等，放到CO?培养箱中培养，细胞贴壁后再换培养基。6、注意观察细胞生长状态，及吋换液或传代。㈡、换液：1、实验前做好相关准备工作（超净工作台的无菌环境；准备好实验相关仪器和试剂）。2、取出培养瓶，用75%洒精消毒后放入超净实验台。3、吸弄旧培养液，用适量（如2ml）PBS（磷酸盐缓冲液）清洗细胞（可根据细胞状态洗1・2遍，一般从没冇细胞的那一侧倒掉）。4、加入适量新鲜完全培养基，放回培养箱继续培养。㈢、传代:1、实验

3、前做好相关准备工作（超净工作台的无菌环境；准备好实验相关仪器和试剂）。2、取出培养瓶，用75%酒精消毒后放入超净实验台。3、吸弃□培养液，用适量（如2ml）PBS（磷酸盐缓冲液）清洗细胞（可根据细胞状态洗1・2遍）。（前面步骤同换液）4、加适当的胰蛋白酶（0.05%）（能覆盖细胞就行），放入细胞培养箱屮消化l-2min（根据不同类型细胞而定）。5、细胞都变圆后加如入等体积的完全培养基终止消化。6、用滴管缓慢吹打细胞，使细胞都悬浮起来成细胞悬液，吸到15ml的离心管中，1000转离心l-3mino7、倒掉上清液，力Ul-2ml完全培养基

4、，将细胞吹散成单个细胞。8、根据细胞浓度把细胞传到几个培养瓶中，加入适量完全培养基（一般癌细胞-个培养瓶分2个），放回培养箱中继续培养。㈣、冻存：1、实验前做好相关准备工作（预先配置好冻存液放入4°C保存，常为10%DMSO+90%血清，配制过程中加入DMSO耍缓慢，且边滴边摇；超净工作台的无菌环境；准备好实验相关仪器和试剂）。2、取出培养瓶，用75%酒精消毒后放入超净实验台。3、吸弃旧培养液，用适量（如2ml）PBS（磷酸盐缓冲液）清洗细胞（可根据细胞状态洗1・2遍）。4、加适当的胰蛋白酶（0.05%）（能覆盖细胞就行），放入细胞培

5、养箱中消化l-2min（根据不同类型细胞而定）。5、细胞都变圆后加入等体积的完全培养基终止消化。6、用滴管缓慢吹打细胞，把细胞都悬浮起来成细胞悬液，吸到15ml的离心管中，1000转离心l-3mino（同细胞传代中步骤）7、倒掉上清液，加入预制的冻存液制成细胞悬液，分装到灭菌的冻存管中,（注意不要加满，预留其结冰后的空间，一般1.8ml的冻存管加入三1.5ml的细胞悬液）。8、写明细胞种类、冻存日期。放入4°C冰箱30min,・20°C冰箱30min,・80°C冰箱过夜，最后放入液氮罐中保存。一、细胞培养注意事项：注意无菌操作，以防细

6、胞污染，定期检查培养箱、超净台，按时观察细胞状态，实验过程屮注意保护自身安全。㈠、注意无菌操作1、实验进行前，超净工作台以紫外灯照射30-60min灭菌，并开启操作台风扇运转30min后，才开始实验操作。2、实验进行前，实验人员应穿戴好实验服，口罩，手套。3、所有拿进实验台的物品都应用75%酒精消毒。4、在酒精灯10cm内进行操作，开盖或封盖前应用酒精灯灼烧灭菌，但注意对有滤膜的培养瓶不应灼烧，以免细胞污染。5、每次尽量只处理一个细胞株，以免发生细胞间污染。6、实验结束后，处理好废液，用75%酒精擦净台而，开启紫外，照射5min以上。

7、㈡、定期检查项目1、培养箱Neo?浓度、温度、及水盘是否冇污染（水盘的水用无菌水，每周更换）。2、CO?钢瓶之CO?压力。3、超净工作台内之气流压力，定期更换紫外线灯管及HEPA（高效空气净化）过滤膜，预滤网（300小时/预滤网，3000小时/HEPA）。㈢、观察细胞状态：1、正常状态下，细胞贴壁生长，当培养液颜色变淡时，应换液。对于培养基屮添加酚红指示剂的，若紫色变深，则应检查CO?供应，若颜色变黄，则可能是换液或传代频率太低。2、当培养瓶屮细胞覆盖率达80%以上时，应传代。3、若发现很浑浊，且有许多漂浮死细胞时，可能细胞被污染，应

8、丢弃被污染细胞并对培养箱进行灭菌操作。二、所需设备CO?培养箱（最好是内置紫外灯）；超净工作台；倒置显微镜；液氮罐;低速离心机；恒温水浴锅；冰箱（・80°C）、（4°C及-20°C）；高压灭菌锅;电热鼓风干燥箱；三、所需