细胞培养技术总结-重要

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1、细胞培养及检测相关技术小结-、细胞培养基配制以1000ml培养基为例。1000ml成骨细胞培养基=850mla-MEM培养液+150ml特级胎牛血清FBS(15%)(1).a—MEMpowder:10.2g/L&67gfor850ml(2).NaHC03:2.2g/L~~~1.87gfor850ml(3).Twicedistilledwater850ml,dissolvethepowderinwater(4).FBS(15%,v/v)150ml(5).Filtertosterilizedbottle(6).Labe1theb

2、ottleandstorein4°C.Notes:4,5shouldbeoperatedinthesterileworkingplace.Andifnecessary,wecanaddsomeantibioticsintothemedium(usuallyinprimarycellculture).二、PBS(10X)NaCl:80g/LKC1:2g/LNa2HP04：14.4g/LKH2P0i：2.4g/LPH二7.4,withHC1orNaOHToomuchPO产isharmfultocell,soonlyverylit

3、tleamountisnecessary.Getsomecertaintodilutethis10timesconcontrationPBSwhonweneed.三、胰蛋白酶Trypsin-EDTA消化液(10X)Thissolutionisusedforcel1releasedfromthecultureflask。ThefinalconcentrationofEDTAis0.05%;ThefinalconcentrationofTrypsinis0.53mrnol/L.Take40nilsolutionforexampl

4、e(10X)(1).Trypsin:40mlX0.05%X10=0.02g(1).EDTA:40mlX0.53X103X376(molecularweight)X1010=0.0797g(2).PBS40ml（4）.Filteranddistributeitinto2mlsterilizedtubes.四、细胞冻存液细胞冻存液是DMSO（二甲基亚砚）和FBS的混合液，DMSO与FBS的体积比为1：2,混合均匀后过滤，加0.5ml混合液入灭菌过的冻存管，放进-20°C冰箱中备用。五、传代细胞买来时，多为老细胞，细胞活性不强，因

5、此，盂要先传代以恢复其活性。细胞刚买来时，培养瓶里面一般都装满了培养基，在操作时，需要先将培养基移出至干净灭菌的管子备用。1.取光镜观察己长满细胞的培养瓶（下面按一瓶计算加入液体最），进行消化：a）吸取19mlPBS（需用小滤膜过滤去除细菌等）b）弃去旧培养基c）用5mlPBS晃洗培养瓶，弃去PBS,并重复一次。d）在剩余的9m1PBS中加入lml的trypsin+EDTA消化液（消化液为10倍于正常浓度）。过滤后加入培养瓶中。如果细胞贴壁不牢，只需要加一次，2ml；如果细胞贴壁牢固，第一次可加入3~5inl,水平晃动儿秒后

6、弃去，再加入2ml消化液，晃动并轻弹培养瓶底，同时在倒置显微镜下观察细胞形态，当细胞被完全消化下來吋，加入10ml细胞培养液，并将细胞液移至离心管。2.离心,1200rev/min,5niino弃去上清液,晃动离心管使细胞分散,加入培养基10ml,用两个培养瓶分装细胞液；3.标记后半旋开瓶盖放入孵化箱进行培养。Notes：1.细胞不能长吋间处于无液体状态，因此在每个步骤之间，应该作好准备工作，如在步骤l.c）和l・d）Z间，应该先准备消化液，再弃去第二次的PBS清洗液。2.通常情况下，成骨细胞的贴壁力较强，因此口J以弃去第一

7、次的消化液，再加入第二次；反之，如遇到贴壁力较弱细胞，加入一次消化液肉眼可见细胞明显脱落，则只需加入这一次消化液。2.在显微镜下观察细胞脱壁情况时，细胞呈圆形并聚集成团，水平晃动培养瓶时，细胞跟随瓶子晃动，在此，要确认细胞完全从瓶壁上消化下来。3.在分散离心后的细胞时，耍确认细胞分散均匀，因为成团的细胞不利于细胞住长，并且对LDH等实验结果影响较人。六、换液传代后，细胞牛长何两天就需要换一次液，以补充细胞牛长所需的养分。换液询，需在显微镜下观察细胞的生长状态，要特别注意细胞是否被污染,如果是被污染，应弃去污染的细胞。换液时，

8、弃去II」培养基，加入新鲜培养棊，每瓶5ml。Day0Day1Day2Day3Day4Day5Day6Day7七、冻存细胞（缓冻）1.灭菌细胞冷冻管，灭菌前，半旋开管盖，灭菌完毕以后，旋紧；2.取出已准备好的细胞冻存液（见四）；3.按照传代的操作（见五）将细胞脱壁，分散后加入适最培养基，然