细胞培养技术总结.docx

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1、细胞培养技术总结（，，，）1·培养环境的要求（切记无菌操作）工作环境的处理1.实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2.实验用品以70%酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，

2、必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。吸管口切勿碰到容器瓶口 4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒。感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少ClassII)。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。

3、 2·仪器设备的要求定期检测下列项目： CO2钢瓶之CO2压力。CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。 水槽可添加消毒剂(Zephrin1:750)，定期更换水槽的水。3·无菌处理1）器具的无菌操作试验用玻璃塑料用品清洗及其消毒灭菌清洗：a玻璃器皿的清洗（酸液由重铬酸钾，浓硫酸，蒸馏水配置）浸泡—刷洗—浸酸—冲洗b胶塞的清洗刚买回的常含滑石粉等杂质，先用自来水冲洗后再按常规方法处理。2%NaoH或洗衣粉煮沸10-2

4、0分钟---1%稀Hcl浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟—晾干备用c塑料制品的清洗2%NaoH浸泡过夜—自来水冲洗--5%稀Hcl浸泡30分钟—自来水和蒸馏水冲干备用。2）消毒灭菌：a物理消毒法（紫外线，湿热，烘干，过滤）含碳酸氢钠溶液要过滤，高压会分解，培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：121℃,15磅,20分钟；布类、玻璃制品、金属器械等物品：先121℃,15磅,20分钟，然后在烘箱中烘干；玻璃瓶：干热灭菌170℃,4小时           b化学消毒法（70%酒精，千分之一的新洁尔灭）c抗生素：培养用液灭菌或预防培养物污染3）无菌的操作技术培养物的污

5、染及控制污染种类：（1）细菌污染：培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。（2）真菌污染：培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。（3）支原体污染：培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。（4）病毒污染：尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不

6、安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。（5）非同种细胞污染： 污染来源：（1）不洁的动物组织标本：正常情况下组织来源是不带菌的，但由于取材不小心也会染菌，也有可能动物体本身带菌，不用浓的抗生素清洗，会导致培养污染。（2）空气：如果无菌操作区与外界隔离不严，空气中会带菌。其次，超净台使用过久，滤板堵塞也会污染。工作时不带口罩外界气流过强会污染。再者，南方空气潮湿，空气中容易带菌，操作不注意会染菌。（3）清洗消毒：培养用液除菌不彻底，培养器具清洗消毒不彻底。（4）操作不过关4试剂及器材的准备1）培养基1.液体培养基贮存于4oC冰箱，避免光照，实验

7、进行前放在37oC水槽中温热。2.液体培养基(加血清)存放期为六个月，期间glutamine（谷氨酰胺）可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。3.粉末培养基配制(以1升为例)：3.1.细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强