从RNA到电泳鉴定研究进展之十七

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1、研克进畏之十七从RNA到电泳鉴定一、RT-PCR原理：提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板,用VI型胶原蛋白的al链的编码序列的特异性引物进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。1)随机六聚体引物：当特定mRNA由于含

2、有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNAo用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNAo2)Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%,故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到

3、的cDNA在数量和复杂性方面均要小。1)特异性引物：用含目标RNA的互补序列的寡核昔酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3'端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA,导致更为特异的PCR扩增。缺点是只能用于单一基因的PCR实验。二、引物设计引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引

4、物长度(primerlength),产物长度(productlength),序列Tm值(meltingtemperature),引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability,用AG值反映)，形成引物二聚体(primerdimer)及发夹纟吉构(duplexormationandhairpin)的能值，在错配位点(falseprimingsite)的引发效率，引物及产物的GC含量(composition),等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据

5、有关参考资料[24],引物设计应注意如下要点：1）引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74°C,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。2）引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是丁端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3,端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。3）引物3,端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个

6、碱基，因此应当避免在引物的3,端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5,端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。4）引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5）引物所对应模板位置序列的Tm值在72°C左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）,在Oligo软件中使用的是最令1（近法（thenearestneighbormethod）。6）AG值是指D

7、NA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3,端AG值较低（绝对值不超过9）,而亍端和中间AG值相对较高的引物。引物的3,端的AG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。7）引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。8）对引物的修饰一般是在亍端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列。三、总RNA提取如果使用试剂盒，则根据kit的使用说

8、明就可以。也可使用传统的单试剂方法。但是需要注意以下几个问题。注意RNA的降解：RNA降解的可能性很大，但是并不可怕。书上要求塑料耗材需要用DEPC浸泡过夜后高压灭菌。如果使用的是一次性的塑料耗材，可以直接高压灭菌用于实验。使用的蒸憾水需要配成0.1%DEPC水过夜后高压灭菌。操作过程，尽量不要交谈，可以不带口罩。注意DNA的污染：细胞裂解后离心，取样时需要小心，只能取上清夜，如果取到中间层则可能引起DNA的污染。电方中羊是书宪胶中液奂新人为四、逆转录一般使用的是2步法。逆转录反应