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1、PCR技术详细步骤一从RNA抽提到电泳鉴定（2010-04-2121:16:04）转载标签：分类：须一技之长，专业杂谈RNA抽提一，准备工作1,实验器具与材料：（1）移液枪:lml、200ul、10ul（2）吸头：lml、200ul、20ul（3）吸头台：放置lml吸头的一个，放置200ul和20ul的吸头一个（4）EP管1.5ml、lOOul（5）玻璃研磨器（6）容量瓶：1000ml（7）盐水瓶:100ml（8）15ml塑料管一个（配75%乙醇用）2,实验器具的处理与准备（1）塑料制品：（包括吸头、EP管等）将赠料制品逐个浸泡于1%°DEPC水屮（必要时小枪头需要用吸管打入DE
2、PC水）37°C过夜，然后送至高压3次，后在80°C烘烤箱中烘干（或置于37°C中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。（2）玻璃制品：（主耍是玻璃研辭器）先泡酸过復，冲洗干净后，在1%oDEPC水中泡8小时左右，37°C烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。（3）金属制品：（镶了等）先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水）1,试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制:1000ml双蒸水中加lmlDEPC,放在1000ml容最瓶屮静置4小时后备用。配75%乙醉的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC,37°C过夜，送至高
3、压。（2）75%乙醇（要在抽提时现配）:用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇=1:3）,然后放于-20°C备川。（3）异丙醇：放入棕色瓶（4）氯仿：放入棕色瓶（5）Trizol：100ml/瓶存放于4°C二，抽提时注意事项：全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的-•次性的手套接触可疑污染物。三，抽提步骤1.匀浆化作用取约100mg鼠脑组织放于玻璃研辭器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研辭组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。2.分离阶段^lmlTrizol中
4、加0.2ml氯仿。盖紧样甜管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。3.RNA的沉淀将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500U1）,加入0・5ml异丙醇,混匀后放于-20°C中1小吋，后12000rmp离心10分钟。34.RNA的洗脱小心倒掉上清，留取沉淀。加lnil现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。1.RNA的再溶解小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）。注意不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的D
5、EPC水溶解，在55-60°C下孵育10分钟助溶。2.RNA的保存提取的RNA保存于-70°C超低温冰箱中，或立即用丁•逆转录。TRlzol法抽提总RNA细胞1X107组织100mgI加lmlTRlzol细胞用lml加样器吹至液体澄清口无细胞团块I匀浆（要彻底，后转至EP管）（组织匀浆量＞100mg时分装lml/每EP管）I颠倒混匀10F,室温5分钟I加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）I颠倒混匀15S,室温5分钟I4°C,离心12000rmp,15分钟I转上层水相（约400-500u1）于另一新1.5mlEP管中I加等体积异丙醇（约400-500u1）,混匀后
6、-20°C中1小时I4°C,离心12000r叩，10分钟I弃上清I加冰预冷的75%乙醇（川高压后的DEPC水配）1ml4°C离心7500rmp,5分钟弃上清，超净工作台开风机干燥约30分钟（不能完全干燥）溶于DEPC水中至20u1（10u1-20u1）（可在55-60°C水中,<10分钟助溶）I立即保存于-70°C超低温冰箱中，或立即川于逆转录4逆转录（RT）一，准备工作1,实验器具与材料：（1）移液枪：200uK10ul（2）吸头：200uk20ul（3）EP管1.5ml、lOOul（4）水浴箱2,实验器具的处理与准备塑料制品:（包括吸头、EP管等）将塑料制詁逐个浸泡于1%°D
7、EPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37°C过枚，然后送至高压3次，后在80°C烘烤箱屮烘干（或置丁・37°C中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。1,试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制:1000ml双蒸水中加lmlDEPC,放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC,37°C过夜，送至高压,后分装到几个1.5mlEP管中,-20°C中保存备用。（
