树突状细胞疫苗在肝癌和肾癌免疫治疗中的基础与应用研究

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1、中山大学博士学位论文树突状细胞疫苗在肝癌和肾癌免疫治疗中的基础与应用研究姓名：周军申请学位级别：博士专业：肿瘤学指导教师：夏建川20090519中山人学博士学位论文树突状细胞疫苗在肝癌和肾癌免疫治疗中的基础与应用研究树突状细胞疫苗在肝癌和肾癌免疫治疗中的基础与应用研究专业：博士研究生：导师：肿瘤学周军夏建川教授中文摘要第一部分肝癌相关重组腺相关病毒载体的构建及在肝癌树突状细胞疫苗免疫治疗研究中的应用目的利用携带甲胎蛋白(Q．fetoprotein，AFP)基因的重组腺相关病毒(recombinantadeno．associatedvirus，rAAV)转染树突状

2、细胞(dendriticcell，DC)体外诱导抗肝癌免疫应答。并通过构建肝癌细胞特异性rAAV，将IFN-),基因导入肝癌细胞进一步增强rAAV／AFP．DC疫苗诱导的抗肝癌免疫应答。方法1．携带IFN吖基因的肝癌细胞特异性rAAV(rAAV／IFN吖)的构建：PCR扩增甲胎蛋白启动子(AFPpromoter，AFPp)、白蛋白启动子(Albuminpromoter，ALBp)和巨细胞病毒增强子(cytomegalovirusenhancer，CMVe)、lB-actin增强子(p．actinenhancer，De)，并按不同的组合插入到rAAV载体中。将含有

3、不同启动子和增强子的rAAV分别转染肝癌细胞株HepG2和Hep3B，筛选出表达活性最强的rAAV。利用筛选出的rAAV转染其他非肝癌细胞株，验证rAAV的肝癌组织特异性。将IFN吖基因插入到肝癌细胞特异性rAAV载体中，利用中山大学博一i：学位论文树突状细胞疫苗在肝癌和肾癌免疫治疗中的基础与应用研究rAAWFN吖转染HepG2和Hep3B，检测IFN吖的表达水平及对HLA-class1分子表达的影响。2．rAAV／AFP．DC体外诱导抗肝癌免疫应答：利用rAAV／AFP转染来源于HLA．A2阳性健康志愿者的DC制备肝癌疫苗，检测rAAV／AFP．DC疫苗的表型

4、、AFP表达及细胞因子分泌。rAAV／AFP．DC疫苗体外刺激自体T淋巴细胞，观察对T细胞亚群和细胞因子分泌的影响。细胞毒实验检测并比较活化的T细胞对肝癌细胞株和rAAV／IFN吖转染肝癌细胞株的杀伤作用。结果1．结果表明rAAV／ALBp在Hep3B中表达活性最强，而rAAV／CMVeAFPp在HepG2中的表达活性最强，并且这两种病毒在其他所有检测的非肝癌细胞株中均没有表达活性。rAAV／ALBp／IFN-1,和rAAV／CMVeAFPp／IFN-丫分别转染Hep3B和HepG2后，两种细胞均能有效表达IFN吖，并且HLA-class1分子表达水平显著上调。

5、2．rAAV／AFP—DC能够有效表达AFP，表面分子CD80、CD83、CD86、CD40、HLA．DR、CDIa表达上调，并大量分泌IL．12。rAAWAFP．DC疫苗体外刺激自体T淋巴细胞大量增殖，检测发现增殖的T细胞主要为CD8+CD69+活化的杀伤性T细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)，而CD4+CD25+的调节性T细胞(regulativeTcell，Treg)则较少，并且活化的T细胞大量分泌IFN—Y，而不分泌IL一4。CTL对Hep3B和HepG2均有不同程度的杀伤作用，并且rAAV／IFN吖转染肝癌细胞后，CTL对肝癌细胞

6、的杀伤作用增强。结论筛选出的两种肝癌细胞特异性rAAV具有相对的肝癌组织特异性，为肝癌的治疗提供了一种靶向性的载体工具。rAAV／AFP—DC疫苗体外能够诱导出有效的抗肝癌免疫应答。rAAV／IFN吖转染肝癌细胞后，能够增强CTL对肝癌细胞的杀伤作用，从而建立了一种增强DC疫苗诱导的抗肝癌免疫应答的新方法，为研究出更有效、更特异的抗肝癌免疫疗法奠定了基础。关键词：重组腺相关病毒；甲胎蛋白；树突细胞；肝肿瘤；肿瘤免疫；丫干扰素一II—中山大学博=I：学位论文树突状细胞疫苗在肝癌和肾癌免疫治疗中的基础与应用研究第二部分病人肿瘤组织来源肾癌细胞与异体树突状细胞融合疫苗

7、诱导抗肿瘤免疫：体外实验结果与临床反应目的肾细胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)已经被证明对免疫治疗比较敏感，本研究旨在探讨病人肿瘤组织来源肾癌细胞与异体树突状细胞(dendriticcells，DC)融合疫苗诱导抗肾癌免疫反应。方法将10例HLA—A2阳性肾癌病人的原代肾癌细胞与来源于HLA．A2阳性健康志愿者的DC融合。通过流式细胞仪和共聚焦显微镜检测融合细胞的表型。在体外实验中，用异体DC／RCC融合细胞刺激自体T淋巴细胞，检测T细胞的增殖、IFN吖分泌及杀伤性T细胞(cytotoxicTlymphocytes，CTL)活性。在临床试验中

8、，10例病人分别免疫接种