树突状细胞和CIK细胞介导肝癌免疫治疗的实验与临床研究

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1、中山大学博士学位论文树突状细胞和CIK细胞介导肝癌免疫治疗的实验与临床研究姓名：高维实申请学位级别：博士专业：普通外科指导教师：区庆嘉2003.5.3中山大学博=E研究生论文树突状细胞和CIK细胞介导肝癌免疫治疗的实验与临床研究专业：博士研究生：导师：外科学高维实区庆嘉教授摘要／【研究背景】

2、＼＼生物治疗或免疫治疗被认为是肿瘤治疗的第四种模式。上世纪90年代以来，抗原呈递与免疫识别理论等肿瘤免疫学研究的突破性进展和多种免疫效应细胞的研究进展，使肿瘤的免疫治疗受到了广泛重视。其中，基于树突状细胞(dendriticcells，DCs)瘤

3、苗的主动特异性免疫治疗(activespecificimmunotherapy，ASI)和细胞因子激活的杀伤细胞(cytokine·inducedkiller，CIK)的过继免疫治疗(adoptiveimmunothempy)是近年备受瞩目的两个方向。7本文通过研究DCs瘤苗的制备与活化、CIK细胞的诱导与生物学特性、以及DCs瘤苗与CIK细胞的协同抑瘤作用，建立基于DCs瘤苗和CIK细胞临床免疫治疗的关键技术，在此基础上，初步开展原发性肝癌患者的临床免疫治疗。／、／【研究内容】＼＼一、肝癌冻融抗原负载树突状细胞瘤苗的制备与活化材料与

4、方法：从50mL健康人(n=6)外周血分离单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcell，PBMCs)，GM-CSF和IL．4诱导5d获取未成熟DCs，分4组继续诱导其成熟，A组：对照组；B组：肝癌细胞冻融抗原负载；C组：TNF．a诱导；D组：TNF—c【诱导加抗原负载组。均于7d收获DCs，FCM和双标记免疫细胞化学法检测DCs成熟标志，双抗体夹心ELISA法检测IL．12。!些查兰竖主竺窒圭笙壅一结果：DCs产出率为(2．74士2．56)×106。DCs标志FCM检测结果，各组CDllc和CD54阳性率均

5、高于95％，显示了较高的纯度；肿瘤抗原负载可促进CD86、CD80、HLA．DR表达及IL。12p40分泌；TNF．a促进CD86表达的作用更显著，但不影响IL．12分泌。显示两者可能存在不同的作用机制，具有互补性。依次用TNF．q诱导后再负载肿瘤抗原，各项成熟标志均维持在高水平[CD86．"(51．04+1．50)％，CD80：(21．61士0．73)％，HLA．DR：(26．33士1．78)％，IL-12p40：(635．42士27．18)ng·L。／106cells]，且CD86表达和IL．12分泌水平进一步升高(P<0．01)

6、。免疫细胞化学染色结果显示各组均高表达DCs标志CD54，部分CD54+细胞表达HLA．DR，以TNF．a诱导加抗原负载组最强。二、细胞因子诱导的杀伤细胞的生物学特性研究材料与方法：用含IFN．扎ILl．13、IL．2、CD3单抗的RPMI1640培养基培养非贴壁PBMCs，诱导CIK细胞。同时诱导LAK细胞作为对照。FCM检测CIK细胞表型CD3和CD56。采用非放射性乳酸脱氢酶(LDH)释放法，检测CIK细胞和LAK细胞对肝癌细胞株BeL．7402细胞毒活性。用双标记免疫细胞化学染色技术检测CIK细胞HLA—DR、CD54和CD5

7、6、CD3分子表达。结果：非贴壁PBMCs经多种细胞因子诱导可大量增值，第2～3周为CIK细胞增殖高峰。经15d诱导，CIK细胞可增加34．45士4．96倍，28天可增加106倍。LAK细胞增殖缓慢，显著低于同期CIK细胞增殖率(P<0．01)。CIK细胞经7d诱导，CD3+CD56+细胞开始明显扩增，诱导2周后其增殖达到高峰期，可扩增293倍，4周可扩增1094倍。LAK细胞中主要为CD3+CD56‘淋巴细胞、CD3‘CD56+细胞及少量CD3+CD56+细胞。不同效：靶比例CIK细胞对肝癌细胞株BeL-7402的特异性溶解率显著高

8、于LAK细胞(尸<0．01)。CIK细胞的细胞毒活性显著高于LAK细胞(P<0．01)。免疫细胞化学染色结果显示，CD3+CD56+细胞抗原分布在细胞膜和胞浆，细胞体积略CD3细胞大，细胞表面有大量伪足，CIK细胞高度表达HLA．DR和CD54抗原，抗原主要分布在细胞膜。三、DCs瘤苗对自体CIK细胞生物活性的影响Jl中山大学博士研究生论文材料与方法：取诱导7d的活化DCs瘤苗和诱导7d的自体CIK细胞混合培养(DC．CIK细胞)，同期自体CIK细胞为对照组。检测2、8、14d的DC-CIK细胞CD3与CD56表型、培养上清IL．12

9、的水平、及混合培养8d时对肝癌细胞的细胞毒效应；双标记免疫细胞化学染色检测CD54和HLA．DR分子的表达。结果：混合培养14d的DC—CIK细胞增殖率显著高于CIK细胞(P