还原糖含量测定条件探究

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1、还原糖含量测定条件探究牛命科学学院2015/5/5还原糖含量测定条件探究【摘要】比较了两种DNS试剂测定还原糖含量的影响因素。探讨了试剂添加量、显色时间、测定波长以及显色后存放时间对测量结果的影响。结果表明，DNS试剂的用量1.5ml,沸水浴显色时间5min,显色定容30min后，分别在540nm波长条件下测定，数据的准确性和稳定性较好。【关键字】DNS（3,5•二硝基水杨酸）述原糖比色法测量条件目前，测定还原糖含量的方法很多，3,3■二硝基水杨酸（DNS）比色法是还原糖含量测定的一种常用方法。•其具冇简便、快速

2、、灵敏度高等特点，但不同资料介绍的条件有很多茅异，影响了测定结果的准确性和可比性"I。木文对DNS比色法测定条件进行探处，讨论影响测量的关键因索，使测量结果更具冇准确性和可比性，为实际采用该方法提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂3,5•二硝基水杨酸、氢氧化钠、丙三醇、苯酚、亚硫酸钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、醋酸钠、冰乙酸，以上药品为分析纯。1.2实验仪器SP-721E型可见分光光度计上海光谱仪器有限公司；Acculab精密电了天平;702■型电热鼓风箱人连干•燥箱厂；DZF-6050型真空干燥箱上海博迅实业冇限公

3、司医疗设备厂；THZ-82A水浴恒温振荡器江苏荣华仪器制造有限公司；802离心机上海浦东物理光学仪器厂；HH-4数显恒温水浴锅国华电器有限公司。1.3实验方法1.3.1DNS试剂配制称取3.25g3,5■二硝基水杨酸溶于少量水中，移入500ml容量瓶，加2mol/L氢氧化钠溶液162.5ml,再加入22.5g丙三醇，摇匀，定容至500ml,储存于棕色瓶放置在冰箱中待用⑶。称取2.5g3,5一二硝基水杨酸溶于少量水屮，加入0.5g苯酚，再溶解0.075g亚硫酸钠、2.5g氢氧化钠和50g酒石酸钾钠，移入500ml容

4、量瓶，摇匀，定容至500ml,储存于棕色瓶放置在冰箱中待用。储存七天后使用⑷。132葡萄糖标准溶液的配置称取大于lg的葡萄糖置于热风干燥箱98°C干燥至恒重，准确称取l.OOOg葡萄糖，用蒸帼水溶解并定容至1000mlo分别按表1进行配置操作，充分混匀后于沸水浴屮加热煮沸5mino流水冲冷却后再分别向各试管屮加入蒸镭水4ml,混匀。以管1为空口对照，540nm波长下测各管的吸光度。绘制吸光度・葡萄糖浓度曲线。表1葡萄糖标准溶液配置管号1234561mg/ml葡萄糖溶液00.2蒸傭水1.00.80.6DNS试齐1」

5、2.02.02.02.02.02.00.40.60.40.20.801.01.3.3DNS测定波长的确定取1.0ml葡萄糖标准液及1.0ml蒸1：留水分别置于10ml试管中，再各加1.5mlDNS试剂，沸水浴加热5min,流水冷却，蒸饴水定容。将葡萄糖显色液・水（空白）、DNS试剂・水（空白）、葡萄糖显色液-DNS试剂（空白）分别在波长450〜600nm范围内进行扫描。1.3.4DNS试剂用量及放置时间的确定在准确加入1.0ml葡萄糖标准溶液的系列10ml试管中，分别加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.

6、0ml的DNS试剂J,沸水浴加热5min,流水冷却、定容。以相同条件下不加葡萄糖标液作空白溶液，波长540nm下测定不同时间的吸光度。1.3.5加热时间的确定取葡萄糖标准液1ml及蒸饰水1ml于系列10ml试管屮，分别加入DNS试剂，置沸水浴中加热、反应1、2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、30min取出，流水冷却，定容。以相同条件下不加葡萄糖标液作空白溶液，在波长540nm下测不同加热时间时溶液的吸光度。136精密度实验取5支管分别加入0.5ml葡萄糖标准溶液和1.5mlDNS试剂，混匀并作空口，

7、沸水浴加热5min,流水冷却、定容。以相同条件下不加葡萄糖标液作空口溶液，波长540nm下测定吸光度。2结果与分析2・1绘制吸光度・葡萄糖浓度曲线。结果如图1所示:图1、540nm波长卜•葡萄糖的标准曲线2.2DNS测定波长的确定DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸(DNS)与述原糖发生氧化还原反应，生成3■氨基・5•硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。关于DNS测量还原糖含量的波长，不同文献有不同的记载：分别1

8、T482-484>490、520、540等®%为了进一步探究其测量的最适波长，考虑相关因素进行波谱扫描，结果如图2所示：DNS试剂1的波长扫描2.3DNS加热时间的确定随着沸水浴加热时间的延长，吸光度变人，但两种试剂均在5min之后吸光度基木不变，说明显色反应基木完成，吸光度较稳定。故DNS试剂水浴加热时间在5min即可，结果如图3所示：图3、DNS试剂加热时间对测定结果