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1、产纤维索酶菌株鉴定随着现代科学技术的不断发展，菌株的分类经历了传统分类、数值分类、化学分类和分子分类的不同阶段。ri前对从自然界中筛选岀來的菌株进行鉴定主耍传统分类和分子分类。传统分类包括：形态特征、培养特征以及生理生化等表观信息的分析，从而依据现有的《伯杰氏鉴定细菌学守则》以及《真菌志》等手则进行分类，为进一步的菌株鉴定奠定基础。由于菌株再平板上的生长受到营养条件以及环境因素等的影响，对于表观的分析分类并不很准确；分了分类是依摒菌株的16/18srDNA或是ITS保疗序列，经过系统发育树的构建分析
2、进行分类。具体方法为：通过PCR扩增菌株的16srDNA/18srDNA/ITS序列，通过Blast比对，利用MEGA5.0软件构建系统发育树来对菌株的准确定位•通过传统分类和分子分类相结合的方法对野生菌株进行分类既科学又准确。本实验通过初痛和复筛，找到了较高产纤维素酶的菌株，主要通过显微镜的形态鉴定和16srDNA来对本实验的野生菌进行鉴定。3.2材料和方法3.2.1菌株来源突变株Co・07由本人筛选并保存322实验仪器SW-CJ-1F型水平超净工作台，灭菌锅，摇床，生化培养箱，显微镜，真空抽滤器
3、，真空冷冻干燥机，GeneQuantTMProDNAyTtNA紫外分光光度计，PCR仪,电泳槽，GIS-2010凝胶成像系统323实验试剂CMC-Na,(NH4)2SO4,MgSO4-7H2O)KH2PO4,NaCl小田冏0和KH2PO4,CaCI2,牛肉膏，蛋白脉，刚果红，电泳缓冲液10*TAE,琼脂糖电泳缓冲^(lOxTAE)Tris碱24.2g冰醋酸5.71mLEDTA3.72g溶解加水定容至lOOmL,置室温下保存，临用前用蒸懈水稀禅，应用工作浓度为lxTAEo324培养基斜面培养基：同22
4、3.1种子培养基：同223.1CMC平板培养基：同筛选培养基2.2.3.1■3.3实验方法3.3.1形态鉴定通过复筛得到的纤维素酶酶活较高的菌採A24,经过活化后接于CMC平板上于37C条件下培养5天后，对询株在CMC平板上菌落的观察，同时运用抒片法对其菌丝体■砲子丝的的显微镜观察。33.2菌株16srDNA分子鉴定3.3.2.1菌株基因组DNA的提取33.2.1.1菌株收集将斜面分别接于250mL含有50mL种子培养基的6个摇瓶中，T30'C,180r/min,培养4d°将得到的菌丝体收集并进行抽
5、滤岀去水分，最后通过貞•空冷冻干燥机对所收集的菌体进行冷冻干燥，干燥后的菌丝体于・20・C保存，用于苗体菌株DNA的提取。332.1.2菌株DNA的提取（1）取真空冷冻干燥的菌体200mg,置于液氮中成分研磨，加入装有400uL缓冲液LP1和8uLRNaseA（1Omg/mL）的离心管中，漩涡能荡lmin,室温放覺lOmin；（2）加入130uL缓冲液LP2,充分混匀，漩涡震荡lmin；（3）12000rpm离心5min,将上清液移至新的离心管中；（4）加入1.5倍体积的缓冲液LP3（约750uL）
6、,立即充分震荡混匀15s,此吋会出现絮状沉淀；（5）将上一步所得溶祓和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，12000rpm离心30s,倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；（6）向吸附柱CB3中加入700uL漂洗液PW,12000rpm离心30s,倒掉废液,吸附柱CB3放入收集管中；（7）向吸附柱CB3中加入500uL无水乙B7,12000rpm离心30s,倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中；（8）向吸附柱CB3中加入500uL漂洗液PW,UOOOrpm离心30s,倒掉废液；（9）将吸附柱CB3置于室温
7、放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中残余的漂洗液；(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离芯管中，向吸附膜的中间悬空滴加150uL洗脱缓冲液TE,室温放置5min,120001pm离心2min,将溶液收集到离心管中;(11)将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放K2min,12000rpm离心2mim将溶液收集到离心管中，放I-20X?冰箱中保存。333菌体基因组DNA的检测33.3.1电泳检测取5uLDNA样品，每份加入luLLoadingBuffer混匀，在1.0%的琼脂糖(含EB的终浓度为0.5
8、ug/mL)凝胶中电泳，条件为100V,20min电泳结束，在GiS-2010凝胶成像系统下观察记录，以检测皋因组DNA完整程度。33.3.2紫外检测用TE稀释所得的基因组DNA提取液(10倍)，应用GeneQuantTMProDNA/RNA紫外分光光度计测定260nm和280nm处得吸光度，根抵OD260/OD280的值判断DNA的纯度以及浓度。3.3416srDNA扩增表3.1PCR反应体系Table3.1PCRreactionsystem反应物加样蜀(pL)lO
