[精品]乳铁蛋白的分离工艺研究

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1、乳铁蛋白的分离工艺研究牛初乳是指奶牛产犊后3d内所分泌的乳汁。科学研究证实，牛初乳是自然界因子最为富集的生物资源Z—。包括重耍的免疫因子和生长因子，如免疫球蛋白（IgG）、乳铁蛋白（LF）及胰岛素生长因了（IGF）等，含量比常乳高10〜100倍。这些生理活性成分具有免疫调节、延缓衰老、促进牛长发育、抑制肿瘤等牛物功能，不仅可以制造功能保健食品，而且还具有开发天然活性生物药物的巨大潜力。乳铁蛋白又称“乳转铁蛋白”，是一种糖蛋白，属于转铁蛋白家族。LF的一级结构是一条多肽链，分子量为70〜80kD,LF上结合有

2、两条糖链，含量为7%左右，其组成包括有半乳糖、甘露糖、N—乙酰半乳糖胺、藻糖等。LF具有多种生物活性，如促进铁的吸收、抑菌抗病毒、促进细胞增殖、调节骨髓细胞生成、调节补体系统、刺激溶菌醜再生、防止脂质过氧化等。在牛初乳中，乳铁蛋白的含量为1.00mg/ml,比常乳高近50倍。我国约有乳牛近430万头，其中成年母牛260万头，以每头乳牛年产初乳50kg计算，每年可产近130t乳铁蛋口，因此生产乳恢蛋口的原料极为丰富，它的开发利用将带來可观的经济效益和社会效益。但牛初乳具冇异味及粘稠度大，难于加工处理的特点，除

3、喂养牛犊z外，利用率非常低。初乳木身所具备的潜在价值得不到充分的反映。因此，高效综合利用牛初乳资源，开发出合理的分离技术路线以提収高纯度、高活性的天然活性蛋白质，特别是开发生物药原料有十分重耍的现实意义。本实验室通过离子交换色谱技术，成功地从初乳中分离出了高纯度的乳铁蛋白，并对此分离过程做了适当的优化，达到了低成木分离高纯度乳铁蛋白的目的。1原料与器材1.1原料与试剂牛初乳：乳牛产犊3d内收集的样品，CM-Sephadex050：进口分装BMK（Shanghai）Sci&TechLtd,CM-SEPHARO

4、SEFASTFLOW,LF标准样品、电泳级丙稀酰胺Acr、电泳级甲叉双丙稀酰胺Bis、分析纯Tris碱（三瓮甲基氨基甲烷），化学纯SDS（I•二烷基磺酸钠），分析纯TEMED（四甲基乙二胺），过硫酸胺Ap,分析纯廿氨酸，考马斯亮蓝R250等。1.2实验仪器SBS100数控计滴自动部分收集器、HD・21・88核酸蛋白检测仪、3057PORTABLERECORDER.BT01-100兰格恒流泵、TH-500梯度混合器、PHS-25型pH计、DYY-8B型稳压稳流电泳仪、DYIII28A型电泳槽、751G分光光度

5、计、TDL-5000B冷冻离心机。2实验方法2.1分离方法2.1.1凝胶的预处理取液体胶与去离子水1混合，浸泡，沉降装柱。以2BV的流速先川碱洗2.5h（5倍胶体积），用去离了水洗至pH值为7.0左右，用酸洗2.5h,用水洗至pH值为7.0左右，再用碱洗2.5h,后用水洗至pH值7.0左右备用。2.1.2牛初乳的脱脂取新鲜牛初乳在冷冻离心机中离心30min（4800r/min,1〜5°C）,去上层油脂。2.1.3阶跃洗脱的方法5%NaC)W峰1.6沁C］洗脫峰i!图1CM-SEPHAROSEFASTFL

6、OW洗在4°C条件下动态上柱吸附8ho去离子水以1BV的流速洗柱约10h,待基线走平，用1.6%NaQ洗脱约需5h,期间杂蛋口被洗脱卜-来，待基线再度走平，使用5.0%NaO洗脱，洗脱产物为LF（粉红色），出峰吋间为1h左右。洗脱曲线见图1。2.1.4CM-SEPHAROSEFASTFLOW的穿透曲线（图2）穿融线一--£1,•0‘4小日寸10另钟‘5小日寸“5分钟t'图2穿透曲线在实验中利用纯度为97%标准样品配制浓度为4.80g/l的LF溶液，在约5BV流速下测定胶体积为62ml的CM-SEPHAROS

7、EFASTFLOW的穿透

8、11

9、线。根据洗脱记录可计算得到在穿透点到达询，CM-SEPHAROSERSTFLOW的实际吸附容量为2g左右。2.1.5透析取洗脱液于透析袋，放在蒸憎水屮24h,中间每8h换一次水，除丈•洗脱液屮的盐类小分子。2.1.6干燥冷冻干燥法，此法对乳铁蛋白的生物活性损失小。2.2分析方法2.2.1蛋白质测定用核酸蛋口检测仪测定蛋口质。2.2.2乳铁蛋白纯度的分析用HPLC法和凝胶电泳法进行纯度分析。3结果与分析3.1交换剂的选择根据乳铁蛋白的特性，木实验选用弱酸性阳离了交换剂，并选川

10、Na型交换剂作为贮存、吸附时的离子型。比较了CM-SEPHADEX050和CM-SEPHAROSEFASTFLOW2种树脂的分离效果。表ICM-5EPHADEXC-50与CM-5EPHARO5EFF洗脱紐比鮫翦子交换剂初乳体积(1)洗脱液体积［ml)洗脱液中LF液度％)LF/TL牛初乳(创)LF的纯度(％)CM-SEPHADEXC-502451.840.415舛9CM-SEPHAROSEFF2621.610.50