flow cytometry

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1、流式细胞仪8/21/20211中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器。8/21/20212中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪的特点单个细胞分析同时多参数分析速度快：10000个细胞/秒统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况分选感兴趣的细胞8/21/20213中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪的原理流式细胞仪的应用流式细胞仪的数据处理8/21/20214中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪的工作原理8/21/20215

2、中国科技大学生命科学实验中心流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM,又名FACS）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量工作原理8/21/20216中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪仪器结构液流系统光学系统激光光源光收集系统电子系统光电转换数据处理系统8/21/20217中国科技大学生命科学实验中心InjectorTipFluoresc

3、encesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid8/21/20218中国科技大学生命科学实验中心细胞被戴上特殊的标记。所用的标记细胞的探针是能够同待分选细胞表面特征性蛋白(抗原)结合的抗体，而这种抗体又能够同某种荧光染料结合。被结合的细胞带上了荧光标记。当稀释的细胞进入超声波振荡器时，极稀的细胞悬浮液形成很小的液滴，一个液滴中只含有一个细胞。液滴一旦形成并通过激光束时，激光束激发结合在细胞表面抗体分子。8/21/20219中国科技大学生命科学实验中心荧光染料及其发射波长FITC525nmPE575nmP

4、I630nm自发荧光与特异荧光8/21/202110中国科技大学生命科学实验中心抗体的选择首选直接标记抗体荧光分子PE最强，适用于弱表达抗原FITC最便宜，适用于强表达抗原间接标记：一般不提倡用8/21/202111中国科技大学生命科学实验中心实验对照的设计空白对照：ALL阴性对照：常用同型抗体对照单色分析：设同型抗体对照多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）阳性对照：检测阴性时8/21/202112中国科技大学生命科学实验中心实验标本的处理单细胞悬液的制备：胰酶消化抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应非特异结合的去除：洗涤

5、和封闭封闭：血清和同型抗体8/21/202113中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪的样品要求单细胞悬液被检细胞或颗粒大小0.2－80um样品中至少20000个细胞，浓度105-107个/毫升8/21/202114中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪的光学系统激光(Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照激光波长:台式机为固定波长488nm,635nm，大型机波长谱线宽包括325，457.9，488,514.5，520.8，530.9，568.3，633，647nmand紫外光UV。光收集系统是由

6、若干组透镜,滤波片,小孔组成，将产生的光信号引导至检测器8/21/202115中国科技大学生命科学实验中心ForwardAngleLightScatterFALSSensorLaser8/21/202116中国科技大学生命科学实验中心90DegreeLightScatterFALSSensor90LSSensorLaser8/21/202117中国科技大学生命科学实验中心DichroicFilter/MirrorFilterplacedat45oReflectedlightTransmittedLightLightSource8/

7、21/202118中国科技大学生命科学实验中心LaserFluorescenceDetectorsFluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)PurdueUniversityCytometryLaboratories8/21/202119中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪的光学系统8/21/202120中国科技大学生命科学实验中心流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。

8、这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。8/21/2021