流式细胞 flow cytometry

《流式细胞 flow cytometry》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、流式细胞术FlowCytometry，FCMFCMFlow~cellsinmotionCyto~cellMetry~measureMeasuringpropertiesofcellswhileinafluidstreamFACS-FluorescenceActivatedCellSorting?FACSisatrademarkofBectonDickinsonImmunocytometrySystems(BDIS).AllFACSinstrumentsareBDISsystems,butnotallcytometersareFACS.PropertyFlowImagi

2、ngPopulationanalysis/Statistics+-Singlecelldetails/architecture-+Livecellsorting(analysis??)+-Analysisinnativemicroenvironment-+Analysisofcellularfunctions(e.g.Ca++influx)+-Needtouseasubstrateforcell“support”-+Multipleparameteranalysis(>5)RelativelyeasyMoredifficultSimultaneousanalysiso

3、fmultipleparameters+/-+/-Analysisofpropertiesofasingleparameter++Costlytechnique++Archivingofpermanentrecords++/-Differences/SimilaritiesbetweenFlowandImagingElectronicsLaserLaserLaserTimeVoltageTimeVoltageTimeVoltageIntensityCounthLowsignalheightHighsignalheight流式细胞术的应用细胞群比例及表型测定(CD4+/

4、CD8+Tcells)细胞因子（激活的细胞因子、CBA）细胞增殖（CFSE、Brdu）细胞凋亡(PI、AnnexinV、TUNEL)细胞周期（PI、DAPI）细胞吞噬杀伤能力（CFSE、CMFDA）信号通路其他（ROS、Ca2+）样本单细胞悬液的制备新鲜实体组织样本的制备酶消化法机械法（剪碎法、网搓法、研磨法300目）化学处理法（胰酶+0.2%EDTA）组织活检、内窥镜取材标本单细胞悬殊液的制备石蜡包埋组织样本的制备外周血单个核细胞样本的制备骨髓细胞单细胞悬液的制备培养细胞的单细胞悬液的制备脱落细胞样品单细胞悬液的制备直接标记抗体（FITC标记抗体）(1)收集1×10

5、6个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。(2)用1ml含5%血清的PBS重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS,避光冰上（4℃）放置30min,离心弃上清。加入200ul1%多聚甲醛固定，待测即可。(3)用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10000个细胞。抗体标记方法B.未标记抗体间接免疫荧光标记法：（1）收集1×106个细胞，用冷的PBS2ml洗涤细胞一次，800rpm离心5min。（2）加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40min

6、,800rpm离心5min，用2ml冷的PBS重悬细胞，800rpm离心5min，洗去未结合一抗，重复一次。（3）加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm离心5min，去上清，PBS洗涤两次。（4）加入0.5ml1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。（5）流式细胞仪检测荧光值,每管计数10000个细胞。C.细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）的制备：（1）待测样本制成单细胞悬液，然后200g离心5分钟，弃上清。（2）用4℃预冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小时（过夜）。（3）调整细胞浓度为106细胞/毫升，取1毫升

7、细胞悬液，用PBS洗三次，细胞重悬于1毫升PI染液中，37℃孵育30分钟即可进行流式分析。（4）PI染液终浓度为50微克/毫升，RNaseA终浓度为20微克/毫升。胞内细胞因子检测目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limitingdilutionanalysis，LDA）和单细胞PCR。原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性。EL