青藏高原甘西鼠尾草内生放线菌抗性菌株筛选

《青藏高原甘西鼠尾草内生放线菌抗性菌株筛选》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、青藏高原甘西鼠尾草内生放线菌抗性菌株筛选［摘要］采用平板涂布法从青藏高原药用植物甘西鼠尾草Salviaprzewalskii中分离内生放线菌24株，以西瓜镰刀病菌Fusariummon订iforme、玉米大斑病菌Helminthosporiumturcicum和玉米小斑病菌Bipolarismaydis为靶标菌，采用平板对峙法研究了甘西鼠尾草内生放线菌的抑菌活性。结果显示，共21株内生放线菌对3种靶标菌表现了不同程度的抑菌活性，占分离总数的85.7%o有4株内生放线菌同时对3种靶标菌表现出较明显的抑菌活性。表型鉴定结

2、合16SrDNA系统发育分析初步确定菌株的分类地位全部为链霉菌。表明甘西鼠尾草内生放线菌作为一类新的微生物资源具有很好的开发潜力。［关键词］甘西鼠尾草；内生放线菌；抗性菌株；分离；筛选鼠尾草属SalviaLinn是唇形科Lamiaceae鼠尾草族Salvieae中最大的一个属，全世界约有1050种，主要分布在亚热带、热带、温带地区，在我国西南地区最多［1］。鼠尾草具有清热利湿、活血调经、解毒消肿等功效，化学成分主要为酚性化合物和菇类化合物［2］,70多个化合物为天然植物中首次发现，二菇类化合物占90%以上，其二菇醍类

3、又占50%以上［3］。目前，药用植物药效成分生产主要依赖植物体本身，但含量少，提取不足，故研究其化合物的新来源显得尤为重要。放线菌是产生生物活性物质最多的微生物［4］,产生的生物活性物质超过11000种，占已发现微生物药物的2/3［5-6］o当前在普通环境中发现新的放线菌和新的活性物质显得极为困难。近年来，一些实验室开始转向植物内生放线菌资源的挖掘，以期从中获得新的生物活性物质［7］。植物内生放线菌是植物微生态系统的天然组成部分，是一个生态学概念［8］,虽经历了几十年的研究，但对其知之甚少。鼠尾草内生放线菌有哪些？与

4、鼠尾草如何协同进化？能否产生与鼠尾草相关的药效成分均未见报道。本研究以青藏高原甘西鼠尾草为材料，依据内生放线菌为适应特殊环境极可能有特殊代谢机制为假设，以农作物病原真菌为靶标，筛选出具有抗菌活性的菌株，以期挖掘具有新次生代谢产物的内生放线菌资源，通过形态特征和系统发育分析确定其初步分类地位，为进一步开发新的抗菌药物奠定基础。1材料1.1样品采集与处理甘西鼠尾草采自青藏高原东部的老榆林乡（海拔3080m）,直接带土采集，封口，放于冰盒内低温保存。有伤口的地方及时用乙醇擦拭消毒，接种前保存在4°C冰箱中。1.2分离培养基

5、准备以S培养基［9］、腐殖酸培养基［10］、改良高氏2号培养基［11］和海藻糖-脯氨酸培养基［11］作为内生放线菌的分离培养基，并以不同的抑制剂组合加入分离培养基来抑制杂菌的生长。抑制剂采用以下组合：100mg•L-1放线菌酮+50mg•L-1重辂酸钾或者20mg•LT蔡唳酮酸+50mg・L-1重鎔酸钾［12-13］。1.3样品消毒将采集的甘西鼠尾草植株根、茎、叶用流水冲掉植物表面的泥沙杂质，在室内晾干，然后把植物样品剪切成小段，浸泡在75%乙醇中5min,用无菌水冲洗，再把样品浸泡在有效氯浓度为1%次氯酸钠溶液中［

6、含1〜2滴聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温-80）］,20min,用无菌水冲洗，样品浸泡于灭过菌的10%NaHC03溶液中10min（使成中偏碱性，利于放线菌生长），用无菌水冲洗，最后干燥备用。1.4仪器设备PCR仪：K960,杭州晶格科学仪器有限公司生产；凝胶成像系统：JY-04S-3C,北京君意东方电泳设备有限公司生产。2方法2.1内生放线菌的分离纯化取约5g表面消毒的植物组织，用无菌剪刀剪成小块，加入10mL无菌水后置于研钵中充分研磨，取匀浆液涂布于分离培养基平板上，28°C避光培养。每隔7d从分离培养基上挑菌

7、，直到30d后结束；高氏2号培养基纯化。2.2抗性菌株筛选筛选出的内生放线菌采用平板对峙法［14］对常见的西瓜镰刀病菌FusariummoniliformeSheld、玉米大斑病菌HelminthosporiumturcicumPass和玉米小斑病菌Bipolarismaydis3种常见植物病原真菌进行抑菌效果检验，放置于28£培养下5〜7d,观察是否产生抑菌圈，测量抑菌圈直径，重复3次，取抑菌圈直径的平均值。2.3表型鉴定筛选出的抗性菌株根据菌落形态，菌丝及鞄子显微特征进行初步鉴定。取分离到的菌株用高氏2号琼脂埋片

8、培养，28°C培养7〜28d,取埋片，用光学显微镜观察基内菌丝的发育情况、气生菌丝、鞄子丝及胞子等的形态特征［15］o2.416SrDNA系统发育分析选用Biomiga公司的试剂盒提取放线菌基因组DNA,选用27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r⑸-GGTTACCTTGTTACGACTT-3z)扩增16SrD