用庆大霉素抗性筛选法选育西罗莫司高产菌株

《用庆大霉素抗性筛选法选育西罗莫司高产菌株》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、用庆大霉素抗性筛选法选育西罗莫司高产菌株【摘要】用紫外线对吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)NP03进行诱变，再采用庆大霉素抗性筛选法进行处理，剂量分别为0、0.01、0.03、0.05和0.08μg/ml，共获得113株抗性突变株，其中西罗莫司产量高于出发菌株的有51株，突变株NP0374#的生产能力达到出发菌株的134%，且遗传特性稳定。【关键词】西罗莫司；庆大霉素；抗性筛选；遗传稳定性Screeningofmutantoverproducingsirolimusicin

2、resistancemethodZhangLiandJiaXiaojing(NeentCenter,NorthChinaPharmaceulicalCo.,Shijiazhuang050015)ABSTRACTAfterthesporesofStreptomyceshygroscopicusNP03bEingtreatedutagenonehundredthirteensirolimusproducingstrainsicinresistancescreening.Thetreatmentdosegre

3、spectively.Thesirolimusyieldsof51mutantsongthem,theyieldof#NP0374us;Gentamicin;Resistancescreening;Hereditarystability免疫抑制剂在器官移植排斥反应的预防和治疗中有极其重要的作用。自20世纪70年代环孢素A用于临床以来，器官移植的成功率大大提高，但探求新的、安全有效的免疫抑制剂的工作一直在继续。西罗莫司(sirolimus)是由吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)

4、产生的大环内酯类抗生素，1977年Morris等首先发现其具有免疫抑制作用，1989年开始把西罗莫司作为治疗器官移植的排斥反应的新药进行使用，临床应用显示它具有很好的抗排斥作用，与环孢菌素A和他克莫司(FK506)等免疫抑制有良好的协同作用，是一种疗效好、低毒、无肾毒性的新型免疫抑制剂［1，2］。西罗莫司除用于器官移植抗排斥药物外，还可用于抗真菌、心血管支架涂料、新合成抗肿瘤抗生素CCI779的原料药，预防和治疗系统性红斑狼疮、胰岛素依赖型糖尿病等，应用前途广泛。本文报道用庆大霉素对西罗莫司产生菌进行处理

5、，以获得高产的抗性菌株。1材料与方法1.1出发菌株吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)NP03(本实验室保存)。1.2培养基分离培养基(%)酵母膏0.1，牛肉膏0.1，葡萄糖1.0，琼脂1.5。斜面培养基天门冬素琼脂培养基。种子培养基(%)淀粉2.0，葡萄糖0.5，酵母粉0.5，蛋白胨0.3；pH自然。发酵培养基(%)葡萄糖3.0，黄豆饼粉3.0，硫酸铵0.5，淀粉1.0，碳酸钙0.3；pH自然。1.3主要仪器旋转式摇瓶机，高速离心机，l。(2)诱变处理紫外线诱变将其孢子悬液置于

6、15处分别照射0、10、20和30s，然后稀释分离，培养。计数并统计致死率，确定紫外处理时间。庆大霉素抗性突变株的筛选将用紫外诱变过的孢子悬液稀释成不同浓度，分别涂布在含有0、0.01、0.03、0.05和0.08μg/ml庆大霉素的分离培养基中，28℃培养10～16d，计数，统计致死率；挑取不同浓度下及对照组的菌落，培养后进行摇瓶初筛和复筛。1.5效价测定高压液相外标法。2结果与分析2.1最佳照射剂量的选择考察紫外线照射时间对菌株致死率的影响(Tab.1)。紫外线有较强的杀菌能力和诱变能力，从Tab.1可

7、以看出，NP03菌株对紫外的耐受力较弱，30s的致死率几乎达到100%，20s的致死率达到75.8%，为保证有较高的筛选几率，选择20s的UV照射剂量。2.2UV照射后庆大霉素剂量对菌株的影响由Fig.1可知NP03菌株对庆大霉素比较敏感，20s紫外照射后的菌株与庆大霉素的浓度存在着剂量效应，当庆大霉素的剂量为0.01μg/ml时的致死率是90.2%，0.03μg/ml的致死率是92.5%，0.05μg/ml时致死率已为97.8%，0.08μg/ml的致死率是99.9%。2.3用庆大霉素抗性筛选西罗莫司高产

8、菌株出发菌株经紫外诱变和庆大霉素处理，在选择平板上随机挑选出113个菌落，摇瓶初筛后有51株的发酵效价比出发菌株高，有2株超过原始菌株30%以上，它们的产量分布见Fig.2，其中突变株NP0374#高出对照菌株34%，HPLC的分析图谱见Fig.3。2.4高产突变株遗传稳定性的考察将突变株NP0374#传4代，培养好后各代子斜面同时进行摇瓶，考察相对效价的变化。Tab.2显示该菌株传代后效价无明显变化，遗传稳