庆大霉素抗性菌株

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1、通过低水平诱导庆大霉素的抗性提高抗生素产量【摘要】目的：筛选出庆大霉素抗性突变株，并且寻找到对庆大霉素的抗性和抗生素产量之间存在的关系。方法：筛选出庆大霉素低水平抗性突变株，然后检测其抗生素产量。此外，突变株的稳定性是在没有庆大霉素的不完全培养基中通过连续传代培养的方法来提高的。在突变株及其亲本中，ActⅡ-ORF4和RedD（RedZ）的蛋白质表达的分析及其比较是使用了Western印迹法。结果：与传统的菌种诱变方法相比，提高抗生素产量的突变株需要在3%到20%的高频率下检测。此外，Western墨迹分

2、析显示，庆大霉素抗性突变株可以激活或者增强actionorhodin（Act）和undecylprodigosin（Red）在链霉菌生物合成过程中的表达，因为其间接或直接的分别上调了ActⅡ-ORF4和RedD（RedZ）的蛋白质表达，还有Act和Red在生物合成途径中的正向调节。结论：提高链霉素和其他细菌抗生素生产的方法，即通过对庆大霉素的低水平抗性的诱导，这种方法是切实可行的。【关键词】庆大霉素突变株链霉菌抗生素1.介绍包括抗生素在内的次级代谢产物主要是丝状菌在进行形态分化时的产物，据我们所知，这些产

3、物中，已知的抗生素大概有17%，放线菌也有74%。芽孢杆菌属的单细胞细菌在这一方面也很活跃。链霉菌属的分子遗传学的最新进展是的我们不仅能够从结构上阐明他们通过基因生物合成次级代谢产物，而且能够从细胞层面上检测整个的细胞分化的过程。举个简单的例子，链霉菌属的ActⅡ-ORF4基因和redD—orf1基因强调了生产抗生素基因簇本身的调节类型。尽管这样的信息到目前为止还没有在有工业价值的菌种上得到成功应用，但是有复合的生物合成的理性方法已经渐渐地用来生产新的化合物了。我们需要的遗传更加稳定的菌株（代谢产物高产）

4、的获得需要多个有利突变的积累。以前经典的菌种改良的方法往往依赖于紫外线辐射或者化学诱变。但是这样的方法在遗传上往往是不连续的，而且会明显导致细胞出现致命损伤，所以我们可以认为这样的方法是相当的低效。众所周知，核糖体是mRNA中是负责翻译遗传信息编码基因的蛋白质。翻译过程的精度对有机体的生存是至关重要的，但是基因移码在翻译时常常会影响精度。氨基糖苷类抗生素是非常常见的基因移码的产物，生成这些东西是因为核糖体的结合，因为改变了核糖体更高级的结构从而失去了其翻译的保真度。现已证明，诱导产生的基因移位的核糖体结构

5、的变化与这些基因各自的表现型相关。基于这些观察，通过改变核糖体的工程从而调节抗生素的生物合成是可行的方案。Ochi和他的同事们已经获得了一类在rpsL基因（编码核糖体S12的蛋白质）上基因突变的菌株，证明是对链霉菌的抗性是有效地，大大影响了链霉菌和芽孢杆菌中聚酮化合物和其他抗生素的生产。我以前的研究表明，另一种氨基糖苷类抗生素庆大霉素也能导致S.coelicolor的放线菌生产过剩。在这里我们进一步研究出合理的方法，通过对庆大霉素的低水平诱导诱导出突变株来提高某些细菌抗生素的生产能力。1.材料和方法菌株和

6、突变株的准备链霉菌spp菌株和其他用到的细菌，列在表一里。原始菌株在琼脂平板上各自培养3到7天的新鲜的孢子悬浮液或细胞。将庆大霉素抗性突变株放入平板生长5到8天（对链霉菌属）或者3到6天（对其他细菌），细胞孢子悬浮液分步在GYM琼脂培养基上分布在不同的浓度上，如表二显示。获得的独立的菌株用作后续的研究。表一表二培养基和培养条件GYM、R4、SMMS、SYM和GGA培养基是和之前描述的一样制作出来。对链霉菌属和s.coelicolor的培养条件和以前报道过的条件是一致的。抗生素生产能力的测定是通过使用三组培

7、养平板实现的，其效价是样本的平均值，如表二和表三所示。实验结果再现性是由至少两个的独立实验保证的（如表二、表三、图一、图二、图三）。表三2.3产量和抗生素的测定2.3.1actionorhodin和undecylprodigosin链霉菌属和S.coelicolor用新鲜的孢子悬浮液接种，在30℃下培育5天。actionorhodin和undecylprodigosin的产出和之前是一样的。图一2.3.2链霉菌灰色链霉菌13189和它的庆大霉素抗性突变株之前在30℃下的GYM液体培养基中培养了2天。之后，

8、细胞被收集起来，接种到GP生产培养基中，GP培养基是在GYM培养基的基础上添加了2%（w/v）MgSO4·7H2O和0.5%（w/v）的蛋白胨，之后会在28℃下培养3天。链霉素的浓度用枯草芽孢杆菌6633来测定。2.3.3放射菌素链霉菌抗生素3720和它的庆大霉素突变株在SYM培养基中生长40h。菌液接种到GGA产物培基上，和之前描述的一样培育5天。产出的放射菌素的浓度是在用醋酸乙酯萃取后在452nm光波处的波长即可测得。2.