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1、运动疲劳诱导大鼠纹状体c-jun蛋白表达图谱变化探究摘要:目的:通过绘制运动疲劳后c❷jun蛋白在纹状体神经核团中的表达图谱,寻找运动疲劳后纹状体神经元应激敏感区,探讨其在运动疲劳中枢调控中的作用。方法:雄性SD大鼠随机分为对照组和实验组,采用免疫组化法观察十天递增负荷游泳运动疲劳后即刻、12h和24h纹状体喙侧层面、中间层面、近尾侧层面和尾侧层面c令jun蛋白的表达。结果:纹状体中间层面的背外侧区和腹外侧区中,12h和24h阳性细胞面密度值显著高于即刻组(❷P❷实验选取雄性SD大鼠,体重(250±20)go动物分笼饲养,自然光照,动物房内温度(20±
2、3)°C,相对湿度为50%〜70%。动物分组包括:对照组(ControlGroup,CG)6只;实验组(ExperimentGroup,EG)投稿日期:2009-08-17基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30771050;30971416)o通讯作者:乔德才。作者简介:侯莉娟,讲师,博士,研究方向运动生理学。18只,实验组根据取材时间分为即刻组,12h组和24h组,每组6只。1.2运动疲劳动物模型的建立动物完成3d适应性游泳运动(15min/day)后开始建模,参照本实验室建立的十天递增负荷游泳运动方式g[5]❷。训练时间为10d,训练在直径
3、为120cm的塑钢圆桶中进行,静水深90cm,水温(30±l)°Co第1〜2d动物游泳训练时间为30min,第3〜5d每天递增30min,第6〜7d每天进行一次力竭性游泳训练,第8-10d每天进行2次力竭性游泳训练,次间间隔6ho游泳训练期间对动物运动能力及活动状态进行观察。对照组相同条件饲养,不参加游泳训练。实验组大鼠模型结束后分别在即刻、12h和24h取材。1.3组织切片与染色1.3.1样本制备10%水合氯醛按0.35mL/kg腹腔麻醉大鼠,灌注生理盐水100mL后用4%多聚甲醛200mL灌注30mine取出脑组织置固定液中下沉后进行冰冻切片。脑组
4、织放入异戊烷中,置于液氮冷冻10s,迅速放入冰冻切片机舱内,切片温度-2CTC,进行连续冠状切片,片厚40um,放入0.01mPBST溶液中待染。1.3.2免疫组化染色1)吸净PBST,加入HC1,室温30min;2)3%H202室温、摇床孵育30min;蒸馅水洗3次,每次5min;O.01mPBST,洗3次,每次5min,10%山羊血清室温、摇床孵育30min;3)加适当稀释度的相应一抗(AB1-40l:800;PSD-951:l000;Shankl:l000;TrkAl:200;MAPK1:1000;p-CREBl:l000),4°C过夜;4)生物
5、素标记的抗鼠二抗(稀释度为1:300),室温、摇床孵育2h;5)加入稀释度为1:200的生物素抗体-过氧化物酶标记的链霉卵白素,室温、摇床孵育2h;6)加入DAB工作液显色,显微镜下观察染色情况,将玻片放入二甲苯中透明、中性树胶封片。阴性对照省去一抗,用0.01MPBS代替。1.4数据处理使用Visilog5.0byNoesis图像采集系统,从喙侧到尾侧以前囱为标准基点,在2.2-1.5、1.4-0.E0.0—0.5,-0.6-2.0的层面范围选取脑片,每张脑片的每个分区中选取一个代表性视野进行观察,记录阳性细胞平均面密度值(AreaDensity,A
6、D)和光密度值(OpticDensity,OD)o所有数据以表示,并用SPSS13.0进行统计,各组间差异用多因素方差分析检验,❷P❷纹状体背外侧的不同区域接受广泛黑质(substantianigra,SN)的DA投射,即纹状体腹侧向SN背侧部位投射密集的GABA纤维,SN腹外侧区神经轴突与纹状体背侧区神经元胞体形成广泛的突触联系°West等的实验观察到,纹状体中与肢体运动相关的神经元位于其外侧区,尤其是背外侧区,与前肢技巧性运动和肢体操作式运动相关的神经元部分分布在外侧纹状体,提示大鼠纹状体神经元的分布有一定的功能定位[8]❷。腹侧纹状体神经元向广泛
7、的SN的DA神经元传导信号,而背侧神经元是接受DA细胞传入的主要区域。与本实验观察到c-jun高表达的区域相近,本实验室前期工作观察到运动疲劳后纹状体高频放电神经元和爆发式放电神经元分布也集中在纹状体的外侧区域,提示运动疲劳后神经元电变化的区域特征性与纹状体神经元分布与接受投射的区域特征性之间存在高度相关。3.2运动疲劳对纹状体c-jun蛋白表达时间差异性的影响Timofeeva等观察到运动后即刻c-fosmRNA基因表达明显增强,但运动后2H恢复到安静水平,IEG对不同运动强度引起的应激反应程度有所差别,恢复程度有所不同,随着运动强度的增加,c-fo
8、smRNA基因表达明显增加;随着低强度运动时间的延长,C-fosmRNA基因表达增加持续到第7