水杨酸钠诱导大鼠耳蜗热休克蛋白表达的实验研究

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1、中国医科大学硕士学位论文水杨酸钠诱导大鼠耳蜗热休克蛋白表达的实验研究姓名：杨宁申请学位级别：硕士专业：耳鼻咽喉科学指导教师：姜学钧2001.6.1中文摘要、铲——旨～—／７热休克蛋白是一类高度保守的蛋白质，可由多种物理、化学、生物等应激原诱导合成，在保护组织、细胞耐受缺血、缺氧或毒物等损伤时起重要作用。特别是氧化损伤时，热休克蛋白的高度表达可以保护细胞抵御氧化损伤，增强缺血耐受性。而且作为一种内源性保护机制，热休克蛋白能比药物达到更自然的保护作用。在耳科的研究表明耳蜗中热休克蛋白表达的增高明显地降低了强噪声刺激所致的永

2、久性阈移。因而如何有效地诱导热休克蛋白的表达成为近来研究的热点。特别是在不造成细胞损伤的条件下诱导或者潜在性诱导合成ＨＳＰ更具应用前景。水杨酸类药物以其良好的疗效在世界各国被广泛使用。但因大剂量水杨酸类药物会产生一过性听力下降和耳鸣，被认为是一种耳毒性药物。近来却发现水杨酸钠可以减轻噪声及庆大霉素造成的听力损伤。另有实验发现水杨酸钠可以促进热休克蛋白表达。考虑到热休克蛋白的保护作用，我们推测水杨酸钠亦可能在耳蜗中诱导热休克蛋白。因此，本实验以此为出发点，研究水杨酸钠在耳蜗中诱导热休克蛋白的情况，探讨水杨酸钠对耳蜗的作用

3、机制，为其在耳科的应用提供实验依据和理论基础。一／婶料与方法材料：取耳廓反射正常的健康雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠５７只，体重２２０—２６０克，随机分组。１００ｍｇ／ｋｇＳＳ组：１００ｍｇ／ｋｇＳＳ，ｉｐ；２５０ｍｇ／ｋｇＳＳ组：２５０，ｎｇ／ｋｇｓｓ，ｉｐ；５００ｍｇ／ｋｇＳＳ组：５００ｍｇ／ｋｇｓＳ，ｉｐ；对・ｌ・照组：等量生理盐水，ｉｐ；３７。Ｃ组：３７℃环境下，３０分钟后室温下恢复；１００ｍｅ／ｋｇＳＳ＋３７。Ｃ组：１００ｍ∥ｋｇＳＳ，ｉｐ，６０分钟后人３７。Ｃ环境３０分钟，再室温下恢复。以上各组每组９只。阳性对照

4、组３只，热休克处置。方法：（１）ＡＢＲ检测：除阳性对照组外，每组取３只于用药前及用药后４小时和２４小时将大鼠用３％戊巴比妥钠４０ｒａｇ／ｋｇ腹腔麻醉，测试ＡＢＲ阈值。利用Ｄａｎａｅ一７型声刺激器发出频率以２ＫＨｚ为主的ｃｌｉｃｋ声刺激信号，测试强度由９５ｄＢＳＰＬ开始，接近阈值后按５ｄＢ逐档递减，观察Ⅲ波以确定听阈。（２）免疫组织化学技术：其余动物于处理后６小时取材。灌流固定后取出听泡置于相同４℃４％多聚甲醛，解剖显微镜下摘出镫骨，刺破圆窗，挑开蜗顶，内灌流后置于相同固定液４℃２４小时。ＰＢＳ漂洗后置于甲酸一甲酸钠脱钙

5、液中室温下脱钙７天，每Ｅｔ更换脱钙液。再经ＰＢＳ漂洗，入３０％蔗糖４。Ｃ过夜，沉降后行ＯＣＴ包埋，恒冷箱切片机沿蜗轴连续冰冻切片，片厚５斗ｍ。采用免疫组化（二步法）进行ＨＳＰ７０染色。先以０．５％双氧水室温孵育切片，滴加Ａ液（鼠抗人单克隆抗体）及Ｂ液（羊抗鼠ＩｇＧ生物复合剂），ＤＡＢ显色，梯度酒精脱水，封片。以显微图像分析系统计算出热休克蛋白阳性反应产物的平均光密度值。所有实验数据以均值±标准差（ｉ±ｓ）表示，统计分析使用ＳＰＳＳｌ０．０软件包处理，进行Ｄｕｎｎｅｔｔｔ检验和ＳＮＫ检验。实验结果１．２５０ｍｇ／ｋｇＳＳ

6、组和５００ｒａｇ／ｋｇＳＳ组注射水杨酸钠后对大鼠听力产生了暂时性影响，用药后４小时听力明显下降（Ｐ＜０．０５），２４小时基本恢复正常（Ｐ＞Ｏ．０５）。其余各组用药前、后ＡＢＲ阈值差异无显著性（Ｐ＞０．０５）。２．正常大鼠耳蜗外毛细胞呈阳性，血管纹、螺旋韧带表达更・２・低，螺旋韧带中以前庭阶螺旋韧带和鼓阶螺旋韧带呈色较重。ｌＯＯｍｇ／ｋｇＳＳ组与对照组相比，其差异没有统计学意义。２５０ｒａｇ／ｋｇＳＳ组在外毛细胞和血管纹处的表达明显增强，其差异有统计学意义。３７。Ｃｔ＿＿Ｊｔ仅血管纹处表达增高有统计意义。５００ｍｇ／ｋｇ

7、ＳＳ组和１００ｍｇ／ｋｇＳＳ＋３７℃组各部位的差异都有统计学意义。讨论热休克蛋白是一类广泛存在的，进化上高度保守的蛋白质。当生物体受到非致死性生物、化学或物理等因素刺激后，产生热休克反应，主要表现为热休克蛋白的诱导和正常蛋白质合成的抑制。而且热休克反应具有交叉耐性现象，认为其基础是热休克蛋白的上调表达。热休克蛋白有许多家族，尤其ＨＳＰ７０家族是其中的重要活性成分，其保护作用确切而广泛，具有重要的临床意义。结构型ＨＳＰ７０平时在非应激细胞中就有表达，如本实验中所观察到的，在正常非应激状态下，外毛细胞呈阳性反应，血管纹和

8、螺旋韧带的表达更低，在螺旋韧带中以前庭阶螺旋韧带和鼓阶螺旋韧带呈色稍重一些。说明在正常大鼠耳蜗内有较低的结构型ＨＳＰ７０表达。在机体受到应激损伤时，通过基因调控，大量地合成应激诱导型ＨＳＰ７０，在对各种损伤耐受性的诱导中起重要作用。本实验发现在水杨酸钠５００ｍｇ／ｋｇ组，耳蜗的外毛细胞、血管纹及螺旋韧带处的免疫反应强度明显增强。在