大鼠急性脊髓损伤热休克蛋白47的表达变化

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1、大鼠急性脊髓损伤热休克蛋白47的表达变化作者：何玉宝杨晨杨有庚任宪盛【摘要】目的研究老年大鼠急性脊髓损伤（SCI）中热休克蛋白47(HSP47)的表达情况。方法用54只Wistar大鼠制作钳夹型SCI模型，在SCI后3d及每周评价BBB评分，并在1、3、5w用免疫组化方法分析脊髓中HSP47的表达情况。结果正常Wistar大鼠脊髓组织低表达HSP47，在SCI后表达明显提高，且在第5周仍有上升趋势（P＜0.01）。脊髓损伤后灰质、白质分界不清，细胞凋亡明显，HSP47主要在血管及靠近软脊膜处白质中表达。结论老年Wistar大鼠SCI后HSP

2、47表达增加，HSP47可能参与到SCI的病理改变过程中。【关键词】急性脊髓损伤；热休克蛋白47；钳夹型急性脊髓损伤模型老年患者由于脊柱和间盘的退行性改变，急性脊髓损伤（SCI）发病危险更高。胶质瘢痕是脊髓损伤修复的阻碍因素之一〔1〕，而热休克蛋白47（HSP47）在瘢痕形成的过程中起到重要的作用〔2〕。但是对于HSP47在SCI后的表达情况国内外文献尚未见报道。本研究拟通过免疫组化技术研究SCI后HSP47的改变，探索治疗脊髓损伤的新靶点。8　　1资料与方法　　1.1实验动物　　Wistar大鼠（清洁级）54只，鼠龄12个月，体重200～

3、250g，吉林大学实验动物中心提供。　　1.2实验试剂及仪器　　HSP47（1∶200，SantaCruz公司），胶质细胞酸性蛋白(GFAP，1∶50）、神经丝蛋白(NF，1∶100，武汉博士德生物工程有限公司)，UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒（鼠/兔）、DAB显色试剂盒（福州麦新生物技术开发有限公司），多聚赖氨酸（北京中杉金桥生物技术有限公司），甲苯胺蓝（北京化学制剂公司），石蜡配量机、石蜡包埋机、手动轮转切片机（德国LEICA公司）等。　　1.3大鼠钳夹型SCI模型的建立〔3〕　　54只大鼠随机分为正常组，假手术组，S

4、CI组，每组18只。假手术组单纯行T10椎板减压；SCI组接受T10节段的脊髓钳夹损伤。10%水合氯醛腹腔注射(0.25ml/1008g体重)，麻醉满意后，取俯卧位，固定，以肋骨下缘为中心背部剪毛，消毒，按肋骨确定椎体序列，在T8～T12水平剪开皮肤，长约3cm。剪开深筋膜，尖刀紧贴棘突骨面纵形分离椎旁肌，直达椎板表面，显露出T9～T11的椎板和棘突，直至关节突。上自动撑开器，血管钳固定T9～T10棘突，蚊式止血钳咬除棘突、椎板至关节突内侧面，暴露出脊髓硬脊膜，并用动脉夹钳夹脊髓，发现钳夹后尾巴抽搐瘫痪。明胶海绵止血彻底后局部撒青霉素粉末2

5、0万U，逐层缝合肌肉、深筋膜、皮肤，再次消毒。术后分笼饲养，每日2次人工排尿，直至恢复排尿，大约2～3w。青霉素每次5万U/100g体重，2次/d，腹腔注射1w。　　1.4BBB评分〔4〕　　所有动物分别在SCI后3d及每周评价BBB评分。将动物置于直径为2m的圆形平台上，观察记录其后肢的行走及肢体活动。评分分3部分：第1部分为0～7分，评判动物后肢各关节活动；第2部分为8～13分，评判后肢的步态及协调功能；第3部分为14～21分，评判运动中爪的精细动作，3项满分为21分。　　1.5HE染色、尼氏染色和免疫组化染色　　正常组、假手术组和SC

6、I组在1、3和5w分别处死6只。10%水合氯醛腹腔注射(0.3ml/1008g体重)，达深度麻醉后，剪开胸腔，暴露心脏，自左心室通过静脉导管至升主动脉，切开右心房，快速灌注100ml0.01mmol/LPBS缓冲液冲洗血管，待右心耳留出液体基本无色，继以150ml含10%中性福尔马林缓冲液灌注固定。自背部打开椎管，取出脊髓损伤区为中心的脊髓组织长约2cm，并以10%中性福尔马林缓冲液4℃下固定24h后，以脊髓损伤区为中心修块，长约3mm。然后各级酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋。切片机以脊髓损伤区为中心切片，片厚2.0μm。切片脱蜡至水

7、，行HE、尼氏染色和SP法染色〔5〕。各级酒精脱水、二甲苯透明、树胶固封。用0.01mmol/LPBS缓冲液代替一抗做阴性对照。　　1.6HE染色、尼氏染色和免疫组化染色结果判定　　HE染色后细胞质呈红色，细胞核呈蓝色。尼氏染色后尼氏体呈紫蓝色，胞核呈蓝色。免疫组化阳性表达为胞浆内或者轴突内出现棕黄色颗粒。在低倍镜（10倍）下选取阳性表达密集区，在高倍镜（400倍）下观察细胞形态、染色定位和程度。每个时间点选取6张切片，每张切片随机选取5个不同重叠视野，输入计算机分析累积光密度值。　　1.7统计学分析　　实验数据均以x±8s表示，采用LD

8、S检验法对结果进行统计分析，结果由SPSS13.0输出。　　2结果　　2.1BBB评分　　正常组和假手术组大鼠双后肢BBB评分均为21分，SCI组损伤后3dBBB评分为0.67±