大鼠急性脊髓损伤热休克蛋白47的表达变化

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1、大鼠急性脊髓损伤热休克蛋白47的表达变化作者：何玉宝杨晨杨有庚任宪盛【摘要】目的研究老年大鼠急性脊髓损伤（SCI）中热休克蛋白47(HSP47)的表达情况。方法用54只。剪开深筋膜，尖刀紧贴棘突骨面纵形分离椎旁肌，直达椎板表面，显露出T9～T11的椎板和棘突，直至关节突。上自动撑开器，血管钳固定T9～T10棘突，蚊式止血钳咬除棘突、椎板至关节突内侧面，暴露出脊髓硬脊膜，并用动脉夹钳夹脊髓，发现钳夹后尾巴抽搐瘫痪。明胶海绵止血彻底后局部撒青霉素粉末20万U，逐层缝合肌肉、深筋膜、皮肤，再次消毒。术后分笼饲养，每日2次人工排尿，直至恢复排尿，大约2

2、～3的圆形平台上，观察记录其后肢的行走及肢体活动。评分分3部分：第1部分为0～7分，评判动物后肢各关节活动；第2部分为8～13分，评判后肢的步态及协调功能；第3部分为14～21分，评判运动中爪的精细动作，3项满分为21分。　　1.5HE染色、尼氏染色和免疫组化染色　　正常组、假手术组和SCI组在1、3和5l/100g体重)，达深度麻醉后，剪开胸腔，暴露心脏，自左心室通过静脉导管至升主动脉，切开右心房，快速灌注100ml0.01mmol/LPBS缓冲液冲洗血管，待右心耳留出液体基本无色，继以150ml含10%中性福尔马林缓冲液灌注固定。自背部打开

3、椎管，取出脊髓损伤区为中心的脊髓组织长约2cm，并以10%中性福尔马林缓冲液4℃下固定24h后，以脊髓损伤区为中心修块，长约3mm。然后各级酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋。切片机以脊髓损伤区为中心切片，片厚2.0μm。切片脱蜡至水，行HE、尼氏染色和SP法染色〔5〕。各级酒精脱水、二甲苯透明、树胶固封。用0.01mmol/LPBS缓冲液代替一抗做阴性对照。　　1.6HE染色、尼氏染色和免疫组化染色结果判定　　HE染色后细胞质呈红色，细胞核呈蓝色。尼氏染色后尼氏体呈紫蓝色，胞核呈蓝色。免疫组化阳性表达为胞浆内或者轴突内出现棕黄色颗粒。在低

4、倍镜（10倍）下选取阳性表达密集区，在高倍镜（400倍）下观察细胞形态、染色定位和程度。每个时间点选取6张切片，每张切片随机选取5个不同重叠视野，输入计算机分析累积光密度值。　　1.7统计学分析　　实验数据均以x±s表示，采用LDS检验法对结果进行统计分析，结果由SPSS13.0输出。　　2结果　　2.1BBB评分　　正常组和假手术组大鼠双后肢BBB评分均为21分，SCI组损伤后3dBBB评分为0.67±0.48，表明SCI模型成功；随着时间延长，评分逐渐上升，表明损伤正在修复，见图1。　　2.2免疫组化结果　　见图2。HE、尼氏染色可见正常组

5、和假手术组脊髓灰质呈典型的蝴蝶形状，灰质和白质边界清晰，而SCI组脊髓正常形态消失，空腔形成，灰质和白质分界消失，神经纤维排列紊乱、减少，神经细胞变性、坏死、凋亡，胶质细胞增生。HSP47主要表达在血管周围及靠近软脊膜处白质中。免疫组化累积光密度值分析见表1。与正常组和假手术组相比，SCI组HSP47表达水平高，且随时间的改变表达量增加（P＜0.05）。表1各组大鼠脊髓中HSP47光密度的比较（略)　　3讨论　　SCI后血管完整性和通透性遭到破坏，血管周围增加的Ⅰ型胶原一方面占据了本来就很狭小的椎管空间，另一方面阻碍重建的血管与周围细胞氧和营养

6、物质的交换，在血管重建过程中起到阻碍的作用。Ⅰ型胶原的生成利于胶质瘢痕的形成而妨碍了脊髓神经元的轴突再生，不利于轴突穿过胶质瘢痕。实验已经证明HSP47和胶原合成有关〔6〕。研究表明在内质网中，HSP47不仅参与Ⅰ型胶原的正确折叠，而且还阻止不正确折叠。HSP47在随后Ⅰ型胶原的分泌、加工和纤维化形成中起关键作用；在HSP47/细胞中应用基因敲除技术证明了HSP47在Ⅰ型胶原分子成熟中的重要性〔7〕。SCI后尽管出现了细胞变性、坏死和凋亡，细胞数目减少，但是HSP47表达明显升高，主要分布在血管周围及靠近软脊膜处白质中，进一步证实了HSP4

7、7的表达增加阻碍了血管的再生。SCI后第1周HSP47即出现升高趋势，且在第5周仍有上升趋势，说明针对HSP47为靶点的治疗应该在SCI后立即给予干预，且应该持续到第5周以上。【参考