运动疲劳对大鼠骨骼肌纤维GLUT4mRNA和蛋白表达的影响.doc

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1、运动疲劳对大鼠骨骼肌纤维GLUT4mRNA和蛋白表达的影响　　摘要：探讨运动疲劳引起大鼠骨骼肌纤维GLUT4mRNA和蛋白表达的变化及其可能机制。方法：Wistar大鼠40只，�S机选取10只为正常对照组，其余采用多级递增负荷跑台运动建立运动疲劳模型，留其成功的20只为疲劳组；测试力竭运动后2组大鼠血糖、血尿素氮、血乳酸、血清胰岛素含量，采用逆转录一聚合酶链反应法测定股四头肌细胞GLUT4mRNA的表达，运用免疫组化法观测该部GLUT4蛋白的表达。结果：力竭运动后即刻，实验组大鼠血糖、血清胰岛素含量均显著低于D组大鼠，而血乳酸水平却显著高于D组

2、大鼠，骨骼肌纤维GLUT4mRNA及蛋白的表达均较D组大鼠显著上调。结论：运动疲劳后大鼠能量基本耗竭、通过非胰岛素途径迫使机体以上调骨骼肌纤维GLUT4tuRNA和蛋白表达来应激，以此延搁由能量衰竭所引起的级联反应，从而形成一种适应性保护反应来减缓运动性外周疲劳的发生。　　关键词：运动疲劳；骨骼肌纤维；GLUT4mRNA和蛋白表达；RT-PCR；免疫组化；大鼠　　中图分类号：G804.2文章编号：1009-783X02-0182-06文献标志码：A　　在运动性疲劳外周机制的研究中，骨骼肌糖代谢是重要的聚焦点，其主要限速步骤是葡萄糖运载体4介导的

3、葡萄糖跨膜转运。有研究显示，GLUT4的表达从根本上决定了其转运葡萄糖的能力；而这种葡萄糖转运能力的高低，又直接影响骨骼肌纤维糖氧化供能的底物水平。巫菲等研究表明，慢性心力衰竭可致大鼠骨骼肌GLIT4mRNA表达显著降低。龚豪杰等的研究显示：2周低氧及低氧训练均能引起野生小鼠骨骼肌GLUT4表达的增多；1h不同强度跑台运动后，野生小鼠骨骼肌GLUT4基因表达量显著增加。唐艳婕等研究结果显示，游泳训练使T2DM大鼠腓肠肌GLUT4蛋白表达增强。杨晓冰的研究认为，运动可以提高胞膜内GLUT4转运速率，且能够增加大鼠骨骼肌细胞内GLUT4的含量，并促

4、进骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取和利用。运动性疲劳能量衰竭学说认为，运动疲劳时骨骼肌纤维葡萄糖几近耗竭、ATP生成减少，运动能力下降而不能维持预定的运动强度。造成这种结果的原因是否与骨骼肌纤维GLUT4的表达有关，相关报道尚不多见。本文通过递增负荷跑台运动建造大鼠运动性疲劳模型，测试力竭后即刻血糖、血尿素氮、血乳酸及血清胰岛素的变化，并运用RT-PCR技术和免疫组化法检测大鼠骨骼肌GLUT4基因和蛋白表达水平，旨在从分子水平上探讨机体适应性变化规律及其可能机制，为运动性疲劳外周机制研究积累有益的资料。　　1.材料与方法　　1.1实验动物及其饲养环境　

5、　选取8周龄健康雄性Wistar大鼠40只，购自甘肃中医药大学实验动物中心-2011-0001），体质量175-200g。采用国家标准啮齿类饲料喂养，自由饮食。室温23-25℃，相对湿度40%～60%，自然光照，安静无噪声。饲养室、用具等每周紫外灯照射消毒。　　1.2建模及分组　　所有大鼠适应环境1周后，在动物跑台上行3d适应性训练，淘汰体重过轻或过重及不适应跑台训练的大鼠，后随机选取10只为对照组；剩余大鼠以Bedford的方法为基准，对常用的多级递增负荷跑台运动方案加以改良，以此建立大鼠运动疲劳模型：坡度为0、三级负荷：I级负荷，Ⅱ级负荷，

6、Ⅲ级负荷，前6d每天按不同等级跑一遍，第7天由Ⅲ级负荷跑至力竭，留取建模成功大鼠20只为疲劳组。　　1.3取材及指标测试　　力竭后即刻将每只大鼠准确称重并尾静脉取血测试尿素氮和血乳酸。后在深麻醉下腹主动脉取血测定血糖及血清胰岛素含量。同时迅速分离两侧股四头肌，并切取相同位置5mm3组织2块，将右侧股四头肌块置于10%甲醛溶液固定后，行常规免疫组织化学法观测细胞膜上GLUT4蛋白含量。将左侧股四头肌块置预冷生理盐水中冲洗积血多次，滤纸吸干水分。用标记好的锡纸包裹，置于液氮中冷冻过夜，然后置于-20℃低温冰箱保存，用RT-PCR法测定GLUT4mR

7、NA表达情况。　　1.4GLUT4mRNA表达的RT-PCR测定　　1.4.1总RNA提取及检测　　将左侧股四头肌块从液氮中取出并复温，采用UNIQlO柱式Trizol总RNA提取试剂盒并严格按要求进行操作。提取后采用紫外分光光度法、1.5%琼脂糖凝胶电泳进行纯度、浓度及完整性检测。　　1.4.2引物　　GLUT4引物序列如下：　　Primer1：5’-GCTTCCTTGGGTTGTGGCAG-3’；Primer2：5’-CTGGAAACCCGAOGGCATCTTG-3’。　　以B-aetin为内参照，其引物序列如下：　　Primer1：5’-

8、CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’；Primer2：5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。　　1.4.3RT方法　　采用