IPTG诱导表达蛋白步骤.doc

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1、IPTG诱导表达蛋白步骤15-11-3配固体培养基和液体培养基，灭菌。配BindingBuffer和脱盐液各500ml。在400ml体积时调节溶液pH值至7.4，定容后转到试剂瓶中。溶液使用前要抽滤（滤除溶液内的气泡和不溶性杂质）。倒板：（5个灭菌的培养皿）①微波加热溶解固体培养基（每次加热30s待有沸腾的迹象时，减少加热的时间）。②超净台操作，以1˸1000的比例（1ml培养基~1μl抗生素）向培养基中加入Kan+(50mg/ml)，摇匀。③倒板。④培养皿放置在超净台上凝固，凝固后将培养皿倒着放入培养箱中15-11-4热转化：（将质粒导入大肠杆菌中）①提前将

2、大肠杆菌（冰上融化）和质粒拿出来融化，混合（冰上操作）后冰上放置30min。②42℃热水浴1min（超过90s会损伤细菌），取出后立即放在冰上冷却2~3min，加入1mlSOC培养基。③摇床上摇45min，150rp，37℃。（使菌体复苏）④离心，3000rpm3min。⑤涂板：取200μl上述液体，喷到板上，用玻璃涂布棒涂匀，放入培养箱中30min晾干后倒着放置。（12~16h）15-11-5配IPTG（0.2g/ml），用灭菌水，超净台操作。挑单克隆：将细菌放入培养液中，以便进行扩大培养和后续实验）①提前准备好几支装有3ml培养基的试管，每管加入3μl K

3、an+抗生素(50mg/ml)，塞好塞子，试管倾斜，是抗生素溶入培养液中。（塞子打开前和塞好后都要在酒精灯上过火灭菌）。②小镊子过火灭菌后，夹取一个枪头，在培养皿上挑一个单个的菌落，轻轻划过。将带有菌落的枪头放入试管中，塞好塞子（试管中培养基液澄清）③将试管放在摇床中培养一晚，37℃,250rpm。（尽量不超过12h）【试管中培养基液变混浊】注意：操作尽量在靠近酒精灯的地方进行。15-11-6扩大培养、诱导表达①以（抗生素˸培养基）1˸1000的比例向培养基中加入Kan+抗生素，摇匀后再加入（100ml培养基）1ml单克隆溶液，摇匀。②摇床上放置2.5h,37

4、℃,180rpm③以48μl IPTG/100ml培养基的比例加入IPTG诱导，移去牛皮纸，恒温摇床上摇6h，30℃,180rpm。冰上放置一晚（抑制细胞生长速率，有利于蛋白质充分折叠）15-11-6离心收集细菌：将培养液倒入50ml离心管中，8000rpm,离心5min，弃上清。沉淀加水冲洗混匀，再离心，弃上清。加PBS冲洗混匀，离心，弃上清。加PBS混匀，将溶液移入PU管中，-20℃保存。15-11-7破碎、离心细胞①4ml细胞液用超声破碎3~4次（探头不能碰到管底和管壁，且离管底1cm左右,4~7ml），至溶液透明。②将溶液分装到1.5ml离心管中，（1

5、0000rpm，4℃,10~15min）离心2~3次至没有白色沉淀。蛋白质纯化脱盐①离心后得到的上清液用针筒抽取过膜，先后用镍柱纯化、脱盐柱脱盐（柱子不能干，不能有气泡）。