人Lrp蛋白多克隆抗体制备

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1、人Lrp蛋白多克隆抗体制备作者：于欣平，宋庆贺，侯立朝，杜可军，熊利泽，陈苏民，陈南春，代忠明【摘要】目的：制备人Lrp蛋白多克隆抗体.方法：克隆全长lrpcDNA编码序列并进行原核表达与鉴定.用镰离子螯合柱(NiNTA)纯化原核表达的全长Lrp蛋白，获得纯度较高的目的蛋白.用纯化后蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并吸附去除非特异性反应成分.结果：Western印迹结果表明，纯化前后的抗血清在69ku处均检测到目的蛋白条带，说明吸附纯化后的抗体可以与Lrp蛋白特异结合.而纯化后抗体Wester

2、n印迹结果目的条带只有一条，说明吸附纯化后得到高特异性抗血清，其免疫印迹的效价在10-6以上，有较高免疫印迹滴度.结论：成功制备了高效价高特异性的兔抗人Lrp蛋白的多克隆抗体，为Lrp功能的进一步研究提供了重要的实验工具.【关键词】脂多糖类0引言脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是细菌内毒素，是革兰氏阴性(G-)细菌感染的主要致病因子，它与某些炎症的发生密切相关[1]•探讨脂多糖刺激后表达发生改变的基因的功能，有针对性地研究其在LPS信号转导通路中的作用部位及作用性质，有助于

3、增加对炎症反应分子机制的认识.人lrp（lipopolysaccharideresponsedgene,lrp）是一种脂多糖应答基因.系本课题组采用基于PCR的改良消减杂交技术，从LPS刺激后的人牙髓细胞差异表达基因文库中筛选出的应答基因[2],GenBank录入号为AF143740.但当时得到的只是该基因编码N端186个氨基酸的序列.随后全长cDNA也被克隆并录入GenBank（录入号NM018360）.本课题组克隆了全长lrpcDNA编码序列并进行了原核表达与鉴定[3].分析表明，全长人lr

4、p编码528个氨基酸，并有亮氨酸拉链的特征结构.本实验对原核表达的Lrp蛋白进行纯化，用纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清.1材料和方法1.1材料大肠杆菌BL21（DE3）由本室保存；重组人lrp融合表达载体pcTAThlrp由本课题组构建保存.LPS（Sigma公司）；HRP标记的羊抗兔IgG及化学发光底物（Pierce公司）;弗氏完全、不完全佐剂（GibcoBRL公司）；NiNTA纯化系统（Qiagen公司）；纯种新西兰大白兔（第四军医大学实验动物中心）.1.2方法1.2.lLrp的表达

5、纯化将重组人lrp融合表达载体pcTAThlrp转化转化BL21（DE3）感受态细菌，挑单菌落扩大培养后IPTG（终浓度为0.2mmol/L）诱导表达6HisTATLrp融合蛋白.将诱导后的菌液2292g/min离心10min,收集菌体，用STE（100g/L蔗糖，10mmol/LTrisClpH8.0,1mmol/LEDTApH8.0）洗1遍；离心收集菌体后用STE重悬,超声破碎菌体（整个过程均在冰浴中），13201g,4°C,离心30min,收集包涵体沉淀，再用包涵体溶解缓冲液（50mmol

6、/LTrisClpH8.0,1mmol/LEDTApH8.0,100mmol/LNaCl,8mol/L尿素）溶解沉淀，13201g/min,4°C,离心30min,收集上清；用镰离子金属螯合柱（NiNTA）纯化Lrp蛋白（按公司提供的操作说明进行），并作SDSPAGE分析.1.2.2抗体制备用约40ng纯化的Lrp蛋白于脊柱两侧多点注射免疫新西兰大白兔，免疫周期为0d,7d,28d,35d.第1次加弗氏完全佐剂，其余3次加弗氏不完全佐剂.第4次免疫1wk后颈动脉取血，37€静置12h分离血清，1

7、467g/min离心10min去除残留红细胞.将制备的抗血清按1：104稀释，以免疫前兔血清为对照对诱导表达Lrp后的全菌蛋白样品进进行WesternBlot分析检测抗体.1.2.3抗Lrp抗血清的吸附纯化和特异性鉴定培养转化pcTAT载体的BL2KDE3）,收菌后用STE重悬浮菌体沉淀,加入溶菌酶（每克湿菌3mg）作用1.5h,加脱氧胆酸钠（每克湿菌4mg）搅动10min,再加1g/L的DNaseI（每克湿菌4uL）,搅拌直至不再粘稠（以上操作均在冰浴进行）；此时向裂菌液中加入等体积的/C预冷

8、丙酮，混匀，冰浴30min沉淀全菌蛋白，然后5867g,4°C离心10min收取全菌蛋白沉淀；沉淀用PBS洗涤1遍后与所制备抗血清于37£摇动共孵2h吸附去除非特异性反应成分.将吸附前和吸附后的抗体分别按1：103,1:104,1:105,1:106稀释作一抗，对诱导表达Lrp后的全菌蛋白样品进行WesternBlot分析.2结果2.lLrp蛋白的表达与纯化诱导2L菌液，表达后的工程菌经超声裂解后分别取上清和沉淀样品进行蛋白电泳，结果显示目的蛋白在包涵体中（图1）.将所得包涵体用包涵体溶解缓冲液