人lrp蛋白多克隆抗体的制备

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1、人Lrp蛋白多克隆抗体的制备作者：于欣平，宋庆贺，侯立朝，杜可军，熊利泽，陈苏民，陈南春，代忠明【摘要】目的：制备人Lrp蛋白多克隆抗体.方法：克隆全长lrpcDNA编码序列并进行原核表达与鉴定.用镍离子螯合柱(NiNTA)纯化原核表达的全长Lrp蛋白，获得纯度较高的目的蛋白.用纯化后蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并吸附去除非特异性反应成分.结果：018360）.本课题组克隆了全长lrpcDNA编码序列并进行了原核表达与鉴定［3］.分析表明，全长人lrp编码528个氨基酸，并有亮氨酸拉链的特征结构.本实验对原核表达的Lrp

2、蛋白进行纯化，用纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清.　　1材料和方法　　1.1材料大肠杆菌BL21(DE3)由本室保存；重组人lrp融合表达载体pcTAThlrp由本课题组构建保存.LPS(Sigma公司)；HRP标记的羊抗兔IgG及化学发光底物(Pierce公司)；弗氏完全、不完全佐剂(GibcoBRL公司)；NiNTA纯化系统(Qiagen公司)；纯种新西兰大白兔(第四军医大学实验动物中心).　　1.2方法　　1.2.1Lrp的表达纯化将重组人lrp融合表达载体pcTAThlrp转化转化BL21（DE3）感受态细菌，挑

3、单菌落扩大培养后IPTG（终浓度为0.2mmol/L）诱导表达6HisTATLrp融合蛋白.将诱导后的菌液2292g/min离心10min，收集菌体，用STE(100g/L蔗糖,10mmol/LTrisClpH8.0,1mmol/LEDTApH8.0)洗1遍；离心收集菌体后用STE重悬，超声破碎菌体(整个过程均在冰浴中)，13201g，4℃，离心30min，收集包涵体沉淀，再用包涵体溶解缓冲液（50mmol/LTrisClpH8.0,1mmol/LEDTApH8.0,100mmol/LNaCl,8mol/L尿素）溶解沉淀，1

4、3201g/min，4℃，离心30min，收集上清；用镍离子金属螯合柱(NiNTA)纯化Lrp蛋白(按公司提供的操作说明进行)，并作SDSPAGE分析.　　1.2.2抗体制备用约40μg纯化的Lrp蛋白于脊柱两侧多点注射免疫新西兰大白兔，免疫周期为0d,7d,28d,35d.第1次加弗氏完全佐剂，其余3次加弗氏不完全佐剂.第4次免疫1in离心10min去除残留红细胞.将制备的抗血清按1∶104稀释，以免疫前兔血清为对照对诱导表达Lrp后的全菌蛋白样品进进行g）作用1.5h，加脱氧胆酸钠（每克湿菌4mg）搅动10min，再加1g/

5、L的DNaseⅠ（每克湿菌4μL），搅拌直至不再粘稠(以上操作均在冰浴进行)；此时向裂菌液中加入等体积的4℃预冷丙酮，混匀，冰浴30min沉淀全菌蛋白，然后5867g,4℃离心10min收取全菌蛋白沉淀；沉淀用PBS洗涤1遍后与所制备抗血清于37℃摇动共孵2h吸附去除非特异性反应成分.将吸附前和吸附后的抗体分别按1∶103,1∶104,1∶105,1∶106稀释作一抗，对诱导表达Lrp后的全菌蛋白样品进行g蛋白，且纯度较高(图2).　　图1－图2　略　　2.2抗血清的检测用收集未纯化抗血清作一抗，以免疫前兔血清为对照对诱导表达Lrp

6、后的全菌蛋白样品进进行WesternBlot分析，结果显示（图3），用所制备的抗血清在69ku位置明显杂到了一条预期的条带，而对照血清泳道相同位置处无相应条带出现.说明所制备抗血清中确有一定浓度的抗目的蛋白的抗体.　　图3所制备抗血清的P).LPS进入体循环时,就会形成内毒素血症,引起明显的病理生理反应.　　　　近年来的实验显示［4］,LPS除引起危及生命的G-菌毒血症外,也参与一些局部特定疾病，如泌尿系统、心血管系统、呼吸系统、消化系统等多个系统疾病.目前认为LPS也是引起人和实验动物中毒性休克的主要因素［5］.而所有这些作用的发

7、挥，都是藉一系列被称为模式识别受体(patternrecognitionreceptors,PRRs)［6］的膜蛋白分子对LPS识别［7-9］，以及一系列相关的胞内信号传导途径对所识别信号的传递和放大来实现的.LPS信号传导途径非常复杂，单凭现有的信号传导分子很难解释其中的一些通路.研究LPS的致病机制，必须寻找新的信号传导分子.　　　　人lrp就是新发现的一种LPS应答基因.功能位点的分析发现,lrp的基因序列中包含两条相互重叠的亮氨酸拉链结构［Lx(6)Lx(6)Lx(6)L］.亮氨酸拉链结构是DNA结合蛋白的特征型

8、结构，该结构往往出现在几种特定的蛋白质中：即与细胞生长代谢相关的分子中（如转录因子、癌基因）.对lrp进行研究可能会有助于进一步认识LPS介导的信号转导通路，增加对炎症反应分子机制的认识.并可能为内毒素血症等LPS相关疾病寻找新的治疗