细胞自噬诱导实验报告

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1、细胞自噬诱导实验报告细胞自噬的实验观察，主要有四种方法。1、提取总RNA,通过RealtimePCR分析相关基因ATG4、ATG5和AT7G的表达;2、提取总蛋白，通过Westernblotting分析LC3的脂化；3、构建GFP-LC3表达载体，通过细胞转染利用荧光显微镜观察LC3颗粒的聚集；4、制备电镜样品，直接观察自噬体的形成。一、pEGFP-C2-LC3质粒的提取与鉴定实验原理一、实验原理质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞屮。质粒主要发现于细菌、放线菌和真

2、菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋门质，质粒的存在使猶主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。质粒载体是在夭然质粒的皐础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗牛素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切臨识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽口J能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方

3、法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：(1)分子量小、多拷贝、松驰控制型；(2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点(3)能插入较人的外源DNA廉:(4)具有容易操作的检测表型。1.煮沸法提取质粒的原理一般分离质粒DNA的方法都包括•3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNAo分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法和疑基磷灰石层析法等。煮沸法提取

4、质粒的原理是：将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液屮，再用沸水浴处理细胞，使宿主细胞细胞壁溶解、细胞膜破坏，蛋白质与染色体DNA变性。而超螺旋结构的质粒DNA因结构紧密，虽然DNA配对虽被破坏，但双链彼此不分开，当温度下降时恢复成超螺旋。当温度下降后，超螺旋质粒DNA可車新恢复其超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA,然后通过异丙醇沉淀上淸液中的DNA,从而冋分离纯化菌体中的质粒DNA。2.限制性内切酶酶切鉴定质粒的原理简称限制性核酸酶是一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。

5、分子生物学中广泛应川的是1【型限制性内切酶在，它们是重组DNA的呈础。绝人多数II类限制酶识别长度为4至6个核昔酸的回文对称特异核昔酸序列(如EcoRI识別六个核甘酸序列：5'・GIAATTC3),有少数晦识别更长的序列或简并序列。DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶木身都会影响限制性内切酶的活性。当微童的污染物进入限制性内切酶贮存液屮时,会影响其进一步使川，因此在吸取限制性内切酶时，毎次都耍用新的吸管头。如果釆用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各口的故适缓冲液和最适的温度。3.琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳通常采丿IJ

6、水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子在凝胶缓冲液(一・般为碱性)中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA相对分子质量越小，迁移越快、相对分子质量越大，迁移越慢。DNA的构象对迁移速度也有一定的影响，向阳极迁移的速度超螺旋大于线状，线状大于开环。电压在一定的范围，线状DNA片段的迁移速率与所加的电压成止比。为了使分辨效果更好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm,因此，我们可以利用这些特性通过琼脂糖凝胶电泳，区别不同相对分子质量的DNA片段和质粒。琼脂糖凝胶电泳利川低浓度的荧光嵌入染料•漠化乙锭进行染色。漠化乙锭含

7、有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团，它与DNA的结合儿乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溟化乙锭分子。山于溟化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料髙出20-30倍，所以当凝胶中含有游离的漠化乙锭(0.5ug/ml)时，可以检测到少至10ng的DNA条带。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料木身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处車新发射出來。因此可在紫外光激发下观察DNA在凝胶中的位置。

8、淤化乙锭可以用來检测单链或双链核酸(DNA或RNA)o但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。事实上，大多数对单链DNA或RNA染色的荧光吋通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的。二、实验目的