高等药物分析

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1、细胞膜色谱法原理CMC是将活性细胞膜结合到硅胶载体的表面，制成细胞膜固定相(cellmembranestationaryphase,CMSP),利用色谱学技术研究流动相屮药物与受体相互作用规律的受体动力学新方法。该法将高效液相色谱、细胞生物学与受体药理学相结合，利用药物与膜受体间存在的特异性亲和力，成功的将药物在体内的作用过程在色谱柱内进行动态模拟。CMC系统以缓冲溶液为流动相，药物为溶质或添加在流动相中，用液相色谱法在动态条件下研究药物与固定相上细胞膜及受体的相互作用，所得到的色谱参数如容量因子k、不对称因子A等，对研究药物作用机制、药物与受体亲和作用及新药筛选等具有重要参

2、考价值。特点基于上述原理，CMC具有以下特点：①CMC可在动态条件下反映受体与配体结合的特异性、饱和性、可逆性和竞争性等特点，并具有手性识别能力；②CMC具冇操作简便、稳定可靠、高效灵敏等优点；③CMSP具有色谱分离和细胞膜活性二重特性，色谱分离和活性筛选可同步完成。在中药等成分较复杂的体系屮，由于CMSP能够特异性、选择性的与活性成分结合，可以排除大量非作用杂质成分的干扰，对中药及天然•药物有效成分的高通量筛选具有突出的优势。面临的问题及对策作为一种新兴的高效生物亲和色谱技术，CMC有着很好的发展前景，但目前在其推广和应用方而仍而临一些问题：①由于各种药物的活性成分在生物体

3、内的作用靶点不同，应选用多种多样的活性细胞膜作为固定相材料；且由于CMSP的保存吋间不长，约在一周之内。所以，使得CMSP的制备困难，而且难以商品化，需要有一定条件的实验室自己制备。②CMC柱对柱压、柱温、流动相的性质及流速等方面要求比较苛刻，耍同时兼顾到色谱分离的条件和CMSP保持生物活性而必需的条件。③在生物体内的靶组织上起效应作用的活性成分不一定是药物的原形，也可能是经体内代谢后的代谢产物，用CMC筛选活性成分，不仅要使用其原材料，H要考虑使用其体内代谢物。④CMC系统屮通常采用硅胶作固定相载体，通过硅胶的吸附作用，将细胞膜固定在其表面。如果细胞膜对硅胶包裹不全，则CM

4、C柱可能还存在硅胶的吸附性，从而干扰药物与细胞膜及膜受体的相互作用。⑤CMC柱所特异性保留的活性成分的量一般较少，难以得到足够的量供分子结构鉴定及药理活性验证使用。⑥目前对于弥散分布或量太少的组织(如一些神经核团，内分泌组织)尚无法建立常规CMC模型，这就需要进行细胞原代培养或细胞株传代培养，获得足量的细胞后才能进行CMC研究。因此，在采用CMC技术进行药物研究的过程中，有许多需耍改进和提高的方面。如考虑到不能同时兼顾色谱分离的条件和CMSP为保持生物活性而必需的条件，樊宏伟等采用了在色谱柱外使脉络宁注射液的活性成分与血小板细胞膜上的药物作用靶点结合的方法；由于细胞膜对硅胶载

5、体可能包裹不全，可考虑选择凝胶等其他材料作为细胞膜的载体；给高效液相色谱仪配备二极管阵列检测器，口J方便地随时查看每个色谱峰所对应的化学成分的紫外光谱图；建立二维的CMC系统，包括CMC—HPLC/MS、CMC-GC/MS,可以同步完成活性成分的分离与结构鉴定，从而极大地提高用CMC筛选活性成分的效率。随着CMC技术研究的不断深入，其在药物研究、分析领域取得突破性进展是可以预期的。细胞膜的制备细胞通过置于低渗溶液中破裂，离心除去细胞核等物质，然后再次离心得到细胞膜。细胞膜的纯度可以通过扫描电镜确定，电镜下细胞膜的片状物及由膜性结构卷曲成的小泡，说明细胞膜的制备方法口J行，并测

6、定细胞膜悬液的总ATP酶活性和膜的蛋口水平。CMSP的制备CMC的关键在于CMSP的制备，将活化的硅胶置于低温反应管屮，加入细胞膜悬液，直至达到吸附平衡。整个吸附过程在真空装置中超声作用下进行，以使细胞膜在硅胶表面分布均一。然后，向反应管中补加等体积的去离了水，使细胞膜的磷脂双分子层进行自身相互作用，玄至硅胶表而形成均匀的细胞膜。离心除去上清液，CMSP用Tris盐酸缓冲液洗涤，除去未结合的细胞膜，制成的细胞膜固定相(CMSP)在几天内可保持受体蛋白的立体结构和生物活性。色谱柱的制备做细胞膜的吸附等温线，计算硅胶饱和吸附量，然后制备相应膜同定相的细胞膜悬液。取活化硅胶，加入细

7、胞膜悬液，将细胞膜固定于硅胶载体表面。通过扫描电镜和能谱法确定细胞膜完全覆盖硅胶表面，然后用低压湿法加入不锈钢色谱柱中。CMSP的表面活性溶液中硅胶表面上的硅醇基对生物大分子的吸附性很强，通常认为是不可逆的。它们会与膜蛋白和脂类分子屮的极性基团作用，细胞膜被牢牢地吸附在硅胶的表面。同时，细胞膜的磷脂双层结构使其具冇两种很强的相互作用：细胞膜极性头间的离了相互作用和膜内部烷基链间的疏水相互作用。吸附在硅胶表面的细胞膜碎片间彼此靠近而融合，并自动形成闭合结构，结果硅胶表而完全被细胞膜覆盖。通常用的化学键合方