地中海贫血基因诊断研究进展

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1、地中海贫血分了诊断研究进展地中海贫血乂称海洋性贫血(thalassemia,简称地贫)是一种遗传性溶血性贫血，由于珠蛋白基因的缺陷使血红蛋白屮的珠蛋白肽链一种或几种合成减少或不能合成，导致血红蛋白组成成分改变，造成血红蛋白不稳定致红细胞溶解破坏的一组溶血性贫血。止常人血红蛋白中的珠蛋白肽链有4种，即B、Y和§链，别由相应的基因编码。人类a珠蛋白基因簇位F16Pter-pl3・3。每条染色体各有2个a珠蛋基因，一对染色体共有4个a珠蛋口基因。根据基因缺失数口的不同，临床表现轻重不一。大多数«地贫是由于a

2、珠蛋白基因的缺失所致，少数曲基因点突变造成。常见缺失为-。〜(3.7)、-a~(4.2)、—(SEA三种类型,常见突变为Ilb-CS,IlbQS,和HbWS。B珠蛋白基因簇位于llpl5.5oB地贫的发生主要是由于基因的点突变，少数为基因缺失。17种常见B地贫突变类型为：CD41〜42(-TCCT)>IVS-2nt654C-T、-28A-G、CD71〜72(+A)、CD71〜72(+T)、CD17A-T、CD26G-A、CD31(-C)、CD27〜28(+0、CD43G-T、-32C—A、-29A-G

3、、-30T->C、CD14〜15(+G)、CAP、Int及IVS-1nt5G-C。现将地中海贫血基因诊断研究方法进展综述如卜地屮海贫血的基因诊断先后经历了DNA点杂交、限制性内切酶酶谱分析、限制性片段长度多态性(RFLP)连锁分析，PCR及相关技术寡核甘酸(AS0)探针杂交和聚合酶链反应(VCR)体外基因扩增，DNA芯片等5个发展阶段，口前基木成熟的检测突变基因技术为RDB,缺失基因检测采用gap-PCR技术。一、a地中海贫血的基因诊断1、Southern杂交：Southern杂交是研究DNA图谱的

4、基本技术，在分析PCR产物和遗传疾病诊断分析等方面有重要价值。木方法用一种或多种限制性内切酶消化基因组DM,用琼脂糖凝胶电泳分离酶解片段，将这些分离后的酶片段人小次序不变地转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上的相应位置，然后与放射性核素标记的DNA或RXA探针杂交，经放射自显影确定与探针杂交的酶解片段的大小及位置。在过去的三十年，Southern杂交技术被认为是分析a珠蛋白基因缺陷的金标准161O因该方法操作繁琐、费时费力、不经济、使用放射性核素，其成功率还大大依赖于所用基因组DNA的质和量，且不能胜任对非缺失

5、型a地中海贫血的基因诊断，因而限制了其在常规诊断中的应用。近年来，由于PCR-ELISA技术的发展,将PCR与核酸朵交、ELISA连为一体，利用ELISA鉴定PCR产物，避免了使用Southern所带来的放射性污染，逐渐取代了Southern杂交在基因诊断领域的地位。2、跨越断裂点的PCR扩增法(gap-PCR):通过设计位于突变基因断裂点两侧的3个引物，构成两个独立的、跨越断点的PCR体系来鉴别样品的基因型。因a基因的缺失使本來止常相距遥远、位于断裂点侧翼的一对引物变得很近，从而就能通过PCR技术扩

6、增出特定长度的PCR产物；另一条引物则设计于缺失区域内，这样仅在正常或杂合子情况下，才会有特异的扩增产物出现。本法能很好地区分正常、杂合子和纯合子。因而此方法广泛地用于对-厂(3.7)、-。~(4.2)、一〜(SEA三种常见缺失型a-地中海贫血的分子诊断［?1。3、多重PCR：多重PCR是基于gap.PCR原理设计的PCR技术，它貝有两大技术优势，一是分析的通量高，二是冇严格的内对照体系。具有简便快速、准确实用而又经济等特点，非常适合于以预防为主而开展的大人群地中海贫血的分了筛查和临床样品的基因诊断。

7、4、扩增耐突变系统-PCR(amplificationrefractorymutationsystem,ARMS-PCR):又名等位基因特异PCR(allelespecificPCR,ASPCR),此类方法是根据PCR过程中要求引物和模板间的严格互补配对來实现对突变位点的检测，原理基于以下两点：(1)错配出现在引物小部时致使稳定性降低，在严格杂交条件下将不能退火；(2)错配岀现在引物3'端时，引物将不能延伸。因此针对不同等位基因设计平行引物，上游引物的3'端和多态性位点互补，这样只有和引物完全互补的序

8、列才能得到扩增，不同的等位基因依赖于所使用的不同引物分别得以扩増。产生的PCR产物可以通过凝胶电泳或是实时的荧光测定来实现对其的分析。TaqDNA聚合酶缺少：T+5,外切酶活性；在一定条件下PCR引物3'末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。这种方法最首耍的一步就是根据已知的突变设计合适的引物，其次就是PCR循环条件的优化，最后通过电泳观察即可判读结果。该法能快速鉴别诊断I