ctni-tnc融合蛋白基因构建﹑表达、鉴定及初步应用

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1、上海交通大学医学院2004级硕士学位论文cTnI-TnC融合蛋白基因的构建﹑表达、鉴定及初步应用中文摘要心肌肌钙蛋白目前已成为诊断心肌细胞受损程度敏感性和特异性最高的标志物之一。心肌肌钙蛋白是由心肌肌钙蛋白I(cardiactroponinI,cTnI)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌钙蛋白C(TnC)组成的三联体复合物,存在于心肌肌原纤维细肌丝上,是心肌细胞的重要调节蛋白，当心肌细胞受到损伤才释放入血，出现时间早，持续时间长。尽管心肌肌钙蛋白已经取代CK-MB成为诊断心肌损伤的新的金标准，然而在临床应用中发现，不同的检测方法对同一患者标本中的cTnI进行测定时，测定

2、值可有30倍或更大差异，给医生诊断带来诸多不便，这主要是因为目前不同cTnI检测方法所使用的抗体、质控品不同等原因造成的。2002年，NIST认证了第一种cTnI参考校准物质，采用Hytest公司专利从心肌组织中提纯获得,该标准品为cTnI-cTnC-cTnT的三元体复合物，近年来该标准物质的使用研究指出，使用该物质并没有使不同cTnI检测方法结果之间的可比性有所提高，因此目前cTnI检测标准化的新热点是二级、三级标准品的建立以及厂商检测抗体的标准化。Ferrieres等试验证明抗cTnI单抗识别抗原表位并不依赖蛋白的三级结构,cTnI大部分序列都具有抗原性,且以N-

3、端、C-端抗原性最强，结合心肌损伤患者血清中cTnI多以cTnI-TnC复合物形式存在的特点,提示我们可以用原核表达的方法直接表达出患者血清中cTnI的主要存在形式。应用PCR技术从人心脏cDNA文库中扩增出cTnI和TnC基因,通过引物设计在两者之间加上57个碱基的linker序列即编码19个中性氨基酸残基TS-(G4S)3-AC的序列,克隆PCR产物,并构建成pET28a-cTnI-TnC表达质粒，转化入大肠杆菌表达菌株BL211上海交通大学医学院2004级硕士学位论文(DE3),用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白的表达,在大肠杆菌中实现可溶性

4、高表达，在摇瓶中的表达量为21mg/L，经一步NTA树脂亲和层析纯化,获得条带单一的目的蛋白。进一步实验了cTnI-TnC融合蛋白的免疫反应性和稳定性。评价了cTnI-TnC融合蛋白在DPC、ACCESS及用国内一对cTnI抗体建立的ELISA法3种系统中的免疫反应性，检测了4种不同液体基质配方中cTnI-TnC融合蛋白的稳定性，并与本实验室制备的cTnI(28-110a)-TnC融合蛋白做了比较，结果表明cTnI-TnC融合蛋白在3种检测系统中均有较高的免疫反应性，找到了使cTnI-TnC融合蛋白在液体状态保持稳定的基质，即含EDTA的10%BSA+PBS基质或含1

5、0%小牛血清的PBS基质，初步认为cTnI-TnC融合蛋白可以作为cTnI免疫测定用的参考标准品。关键词cTnI-TnC，融合蛋白，原核表达，参考标准品，AMI2上海交通大学医学院2004级硕士学位论文CONSTRUCTION,EXPRESSION,IDENTIFICATIONOFcTnI-TnCFUSIONPROTEINANDITSPRELIMINARYAPPLICATIONABSTRACTcTnIhasbeenchosenasoneofthemostsensitiveandspecificmarkerforAMI.Itcanbedectectedwithin4-6

6、hrsaftertheonsetofsymptoms.cTnIpeaksbetween14-36hrsafteronsetofAMIandremainselevatedfor5-7daysafterAMI.cTnIhasprovedtobeadiagnosticandprognosticmarkerformyocardialdamagewithhighdiagnosticsensitivityandspecificity.Itisapowerfultoolforriskstratificationandmanagementofpatientswithunstablea

7、ngina.AtpresentcTnIisconsideredtobeoneofthemostspecificandsensitivemarkersofmyocardialcelldeath.TheformsofcTnIfoundinthecirculationincludecomplexeswithtroponinTandC(TICandIC)aswellasfreesubunits.ThemainpartofcTnIinserumcollectedfromacutemyocardialinfarctionpatientsispresentedin