chap05 RNA的分离纯化

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1、第5章RNA的分离纯化5.1RNA的分离纯化原理5.2特殊类型的RNA的分离纯化本章主要内容5.1总RNA的分离纯化原理一个典型的哺乳动物细胞中含有约10-5μgRNA，其中80％一85％是rRNA，10％～15％为tRNA，mRNA占1～5％，其他的各类RNA不到1％。这些高丰度的rRNA和tRNA的大小和序列确定，可通过凝胶电泳、密度梯度离心、阴离子交换层析和高压液相层析(HPLC)等进行。而不同的mRNA之间在大小和序列方面相差很大，长度从几百碱基到几千碱基不等。但大多数真核mRNA3'端带有足够长的多聚腺苷酸残基，使其可通过与

2、挂有oligod(T)的纤维素亲和而纯化。与DNA的提取类似，RNA的提取一般也要经过细胞组织破碎，除去蛋白质和DNA以及其他杂质，最后得到RNA。需要注意的是由于分解RNA的RNA酶活性很强而且分布极为广泛，以及RNA本身的不稳定性，所以需要特别注意防止RNA被降解。在提取过程的第一阶段细胞的RNA酶应尽快灭活。一旦内源的RNA酶被破坏，RNA受损的可能就大大降低，而纯化的过程就可以按合适的速度进行。RNA的提取方法一般有酚法，去污剂法和盐酸胍法等，这些方法都可以用来提取具有生物活性的RNA。此外，工业上还常用稀碱法和浓盐法提取酵母

3、RNA。用稀碱法和浓盐法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，工艺比较简单。稀碱法使用1％NaOH使酵母细胞裂解，使核酸释放出来。然后用盐酸中和，除去菌体，水溶液中的RNA用酸调pH2.5，即沉淀得RNA粗品。浓盐法是在10％NaCl溶液90℃提取3－4小时，然后提取液经离心后以乙醇沉淀RNA。可以使RNase失活的一些试剂硫氰酸胍、盐酸胍、异硫氰酸胍、亚硫氢胍、苯酚、巯基乙醇、n-月桂肌氨酸、氯仿、RNA酶的蛋白质抑制剂、氧钒核糖核苷复合物、硅藻土(Macaloid)等。这些试剂有的是在细胞破碎之后就要加入的，但是

4、有的是要在分离纯化的后期才加入的。几种提取具有生物活性RNA的方法(1)胍盐法(2)去垢剂法(3)苯酚法(1)胍盐法用盐酸胍提取分离RNA是20世纪50年代提出的，早期由于各实验使用盐酸胍的浓度不同，所得到RNA分子量大小差别较大。后来证明4M盐酸胍不仅可以使蛋白质变性而与核酸分离，而且还有效抑制RNase。但2M浓度的盐酸胍则不能很好抑制RNase，所得RNA分子量较低。但如使用其他抑制剂配合2M盐酸胍使用，则也可获得较高分子量的RNA。盐酸胍法也可用于DNA的提取，但具体例子不多。总的来说，盐酸胍是提取分离RNA的一种方法，但不如

5、酚法和去污剂法效果好，故应用不广。硫氰酸胍用硫氰酸胍提取RNA的方法是首先在1977年由Ullrich等提出，而在1978、1979年由Han和Chirgwin等正式发表的文章得到详述。由于Han的方法中要用连续少量的5M硫氰酸胍溶解RNA，较为繁琐。而在Chirgwin的方法中，培养好的组织或细胞用4M硫氰酸胍溶解，将所得的匀浆铺在氯化铯浓溶液上。由于RNA在氯化铯中的浮密度(1.8g/ml)比其他细胞成分的浮力密度大得多，在超速离心过程中rRNA和mRNA将沉到管底。蛋白将保留在胍基盐裂解液中而DNA悬浮在氯化铯上层液体中。由于C

6、hirgwin的方法能够较易得到回收率和质量都很高的RNA，因此成为20世纪80年代早期提取高相对分子质量RNA的常规方法。然而该方法有一个缺陷，即不适合从很多不同的培养细胞中分离RNA。为此后来发展出一步法。在一步法中，硫氰酸胍用酚、氯仿抽提。该方法不需要超速离心，因而可使许多样品同时进行操作并且提高速度、降低成本，而且在得到最后产物或纯RNA的过程中不会有浪费。有两种情况是一步法所不适用的。一种情况是该方法不适合从含有丰富甘油三酯的脂肪组织中提取RNA。另一种情况是提取RNA的胍基盐被细胞内的多糖和蛋白多糖所不同程度的污染。有报道

7、说这种污染阻止了乙醇共沉淀后RNA的溶解，影响RT-PCR的结果，而且在RNA印迹过程中与膜结合。所以，如果出现了多糖和蛋白多糖污染的问题，应该使用其他的方法和改变RNA沉淀条件。(2)去垢剂法去垢剂不仅广泛应用于DNA的提取，也普遍应用于提取各种RNA。其中使用最多的是十二烷基硫酸钠(SDS)，使用浓度为0.5－2％，单独使用此法提取动物组织的RNA和植物病毒的RNA曾取得一定成功，但不能将蛋白质完全除去。近年来多与酚法、氯仿法、超离心法结合提取不同材料的tRNA、rRNA、mRNA获得十分良好的效果。其中尤以去污剂/苯酚法最受欢迎

8、。(3)苯酚法苯酚法用于提纯RNA先于DNA，现仍是分离提取RNA最好的方法，此法可以单独使用或与其他方法结合使用，广泛用于各种RNA的提取。根据其使用条件及与其他方法结合情况可分为冷酚法、热酚法，皂土-酚法、去垢剂-酚