总rna的分离纯化及逆转录实验

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1、人外周血单个核细胞总RNA的分离纯化及其逆转录外周血单个核细胞分离原理人外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞。单核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同，因此利用一种介于1.075-1.090之间的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque）分离液作密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布，从而分离出PBMC.实验步骤人外周血单个核细胞的分离：1.吸取2ml淋巴细胞分离液加入玻璃试管；2.取抗凝血1ml，用1ml生理盐水稀释混匀，然后沿管壁缓慢加入淋

2、巴分离液（上层为抗凝血，下层为淋巴细胞分离液）；3.2500rpm，离心15min(沉降系数不同，而分离出单核细胞)；4.吸取出最上层血浆（弃用），再吸取单核细胞层至一新的试管中，加生理盐水至管口1cm处，混匀后离心，2500rpm,5min；5.去上清（弃用），加生理盐水0.5ml吹打混匀后，转入1.5mlEP管中，2500rpm,5min；6.去上清（弃用），留细胞沉淀于Ep管中于下一步总RNA的提取。RNA提取原理真核生物，绝大多数基因含有内含子，因此不易直接由基因组克隆目的基因，提取RNA并逆转录形成cDNA是获得真核生物基因的主要手段RN

3、A极易降解，因其RNA酶分布广、活性强、且难以失活，痕量的RNA酶就能够造成严重的RNA降解，实验中采用多种措施抑制RNA酶的活性，减少RNA的降解。酸性酚法抽提RNA其原理是，苯酚在酸性条件下既可溶解DNA，又是蛋白变性剂，联用氯仿可使细胞裂解以及蛋白质与RNA分离，最后利用异丙醇沉淀核酸，获的纯化的总RNA。抑制RNA酶活性的试剂1.焦磷酸二乙酯（DEPC)，一种强烈的烷化剂，能够和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而以抑制外源RNA酶。2.异硫氰酸胍，一种强蛋白变性剂，可使包括RNA酶在内的所有酶活性丧失　抑制外源性RNA酶活性。单核细胞中

4、总RNA的提取1.在上述Ep管中加入500μl变性液（TRIzol:苯酚+异硫氰酸胍）、悬浮细胞，加100μl氯仿，强烈震荡或置漩涡混合器上混匀，冰浴5min.2.4℃,12000rpm,离心20min。吸取上层无色水相转入另一1.5mlEP管中，加入等体积异丙醇，室温放置10min。3.4℃12000rpm,离心20min,去上清，加入500μl70%乙醇（不吹打）4℃12000rpm,离心15min，去上清，烘干。4.加10μlDEPC(焦磷酸二乙酯）水溶解RNA。基因组DNA水相有机相RNA氯仿纯化pH5.7离心加入裂解液(TRNzol-A+

5、)注意事项预防RNase污染1人的唾液中含有大量RNase，皮肤中含有RNase和细菌，而霉菌有可能成为RNase来源。2要使用灭菌的RNA专用的塑料制品，避免交叉污染。3RNA在TRIzol中不会被RNase污染，我们要注意后续的实验中要使用不含有RNase的塑料制品和玻璃器皿。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）原理提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物，利用逆转录酶特异性地反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因。转录产物具有连续的氨基酸编码区，不需要进行剪接，可在原核

6、细胞中表达。完整的逆转录反应体系除需要逆转录酶、适当的反应缓冲液。RNA模板、逆转录酶及四种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）外，还需加入RNase抑制剂。本实验利用人外周单个核细胞中RNA逆转录成cDNA，然后再以此cDNA为模板，利用特异性引物，通过PCR选择性扩增细胞因子的cDNA序列。逆转录反应体系：MgSO42ml2*bcastBuffer5mldNTP0.5mlRNasin0.25mlRandomprimer0.5ml样品总RNA1.25ml总体积10mlRT-PCR扩增细胞因子mRNA反应条件：65oc1min30oc5min30oc-6

7、5oc15min--30min(匀速升温）98oc5min5oc5min反应体系：10*Buffer2mlMg2+1.5mldNTP2mlcDNA5mlTaq0.2mlprimer2mlddH2O17.3ml总体积30ml反应条件：94℃5min94℃45s56℃30s72℃30s72℃5min4℃保存×30cPCR扩增结果与分析PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定具体实验结果分析