细胞核的分离与纯化及RNA、DNA的定量测定

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1、喻娟娟生物化学与分子生物学教研室联系电话:15836197257Email:yujuan8186@gmail.com细胞核的分离纯化及RNA、DNA的定量测定实验六1.了解细胞核分离纯化的基本原理和方法2.掌握DNA、RNA定量测定的原理及方法3.掌握离心机的使用一、细胞核的分离与纯化（上午）二、RNA的定量测定三、DNA的定量测定（下午）一、细胞核的分离与纯化DNA、RNA在细胞中的分布：DNA胞核内(98%)胞质内(2%)RNA胞核内(10%)胞质内(90%)核酸的种类：DNA、RNA结论：DNA主要存在于细胞核，RNA主要存在于细胞质。二、核酸的种类及其分布核酸核苷酸磷酸碱基戊糖定糖法（

2、戊糖的差异）三、核酸的鉴定浓HCl＋3H2O+β－D－核糖糠醛糠醛3，5－二羟基甲苯绿色化合物RNAＯＨˉ水解β－D－核糖+Pi+A.G.C.U地衣酚法:（1）核糖核酸RNA的测定DNAＨ＋水解β－D－２－脱氧核糖+Pi+A.G.C.U-H2O硫酸脱氧核糖ω－羟基－γ－酮基戊醛蓝色化合物二苯胺法:（2）脱氧核糖核酸DNA的测定1、0.25mol/L蔗糖柠檬酸（含3.3mmol/LCaCl2）称取蔗糖86g及CaCl2363mg，用1.5％拧檬酸液溶解并稀释至1000ml。2、0.88mol/L蔗糖柠檬酸液（含3.3mmol/LCaCl2）称取蔗糖301g及CaCl2363mg，用1.5％柠

3、檬酸液溶解并稀释至1000ml。3、核洗液：即0.05mol/L，Tris—HCl（pH7.5）－0.15mol/LNaCl液。在0.2mol/LTris—HClpH7.5缓冲液250ml中加NaCl8.7g再用蒸馏水稀释至1000ml。4、1.5％拧檬酸5、0.9％NaCl6、0.02NNaOH7、离心机8、水浴箱9、常规玻璃仪器试剂与器材用颈椎脱臼法杀死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，除去结缔组织，尽快置于盛有0.9%NaCl的小烧杯中，反复洗涤，尽量除去血液。洗完后将肝脏一分为二，每个小组半个肝，直接将半个肝放在小烧杯里剪碎，剪碎的肝脏放入匀浆器中，加入1.5％柠檬酸钠溶液4.5ml，反

4、复研磨制成匀浆，从而破碎细胞。研磨完后，将匀浆液用单层纱布进行过滤，以除去未研碎的组织。（1）肝细胞匀浆的制备（2）分离细胞质和细胞核将过滤好的匀浆液，放入普通离心机，以3500r/min的转速，离心15min。缓慢倒出上清液（细胞质），移入另一试管中，保留待测定核酸时使用。余下的沉淀物为粗制的细胞核，加入0.25mol/L蔗糖-拧檬酸溶液1ml，用玻捧搅匀，制成细胞核悬液。另取离心管一支，先加入0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液9ml，用滴管吸取上述核悬液，沿管壁缓缓铺于0.88mol/L蔗糖-柠檬酸溶液液面上，再以2000r/min转速离心10分钟，倾去上层液，将管倒立于滤纸上，以吸干余液。

5、沉淀为初步纯化的细胞核。加入Tris－HCl－NaCl核洗液5ml洗涤沉淀，以2000r/min离心10min，除去上层液。得到的白色沉淀即为纯化的肝细胞核。加5ml0.02mol/L的NaOH使细胞核溶解为核液，保留，待测定核酸。0.88mol/L蔗糖-柠檬酸溶液9ml核悬液0.25mol/L0.88mol/L初步纯化的细胞核其它的亚细胞结构半个肝脏＋1.5%柠檬酸溶液4.5ml，制成匀浆单层纱布过滤1次滤液离心：3500r/min；15min上清液（保留！）沉淀加入0.25mol/L蔗糖柠檬酸溶液1ml核悬液沿壁缓铺于9ml0.88mol/L蔗糖柠檬酸液面上离心：2000r/min；10m

6、in上清液（弃去）沉淀核洗液5ml洗涤沉淀上层液（弃去）沉淀纯化的细胞核5ml0.02mol/LNaOH溶解细胞核待测样品鉴定离心：2000r/min，10min细胞核的分离与纯化实验流程试剂（ml）12细胞质液1.0-细胞核液-1.01mol/LKOH1.01.02.显色与比色：取试管三支，编号，按下表操作:试剂（ml）12空白管细胞质RNA水解液1.0--细胞核RNA水解液-2.0-5％三氯醋酸1.02.03,5一二羟基甲苯液3.03.03.01.水解：取试管二支，编号，按下表操作：混合各管沸水浴(10min)冷却加入5%三氯醋酸(8ml)搅匀后离心2000r/min；5min上清液立即混

7、合各管沸水浴(10min)冷却660nm比色测定二、RNA的定量测定试剂（ml）12细胞质液2.0-细胞核液-2.01mol/L过氯酸2.02.0试剂（ml）12空白管细胞质DNA水解液2.0--细胞核DNA水解液-2.0-0.5mol/L过氯酸2.0二苯胺试剂4.04.04.0混合各管冷却离心上清液立即混合各管冷却2000r/min;5min三、DNA的定量测定2.显色与比色：取试管三支，编号，