实验6酵母RNA的分离及组分鉴定.ppt

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1、实验6酵母RNA的分离及鉴定一、实验目的掌握核酸分离纯化的方法掌握用苔黑酚法鉴定RNA组份的原理和方法二、实验原理酵母核酸中RNA含量较多。在细胞中除了核酸外还有Pr、多糖及其他多种化合物；RNA可溶于碱性溶液，在碱性提取液中加入酸性乙醇溶液可以使RNA析出；RNA是由核糖、嘌呤/嘧啶碱和磷酸组成的——在提取的RNA中加1.5mol/L硫酸煮沸5min即可得到这些组份的混合溶液——可对它们分别进行定性鉴定，以证明提取物是否为核酸。RNA的来源和种类很多，提取制备方法各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。苯酚法是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于

2、上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA以白色絮状沉淀析出。该法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法是用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3―4h，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用用0.2%NaOH溶液使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液,用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。1、器材：干酵母粉，天平，抽滤瓶、布氏漏斗、离心机2、试剂：①0.04mo

3、l/L氢氧化钠②酸性乙醇③无水乙醚（C・P）④氨水（C・P）⑤1.5mol/L硫酸⑥5%硝酸银⑦苔黑酚―三氯化铁试剂⑧定磷试剂三、实验器材与试剂四、实验操作取酵母粉7.5g于100ml锥形瓶中沉淀上清液上清液沉淀95%乙醇洗涤2次(每次5ml)乙醚洗涤1次(10ml)乙醚转移沉淀至布氏漏斗中抽滤沉淀在空气中自然干燥RNA粗制品取200mg，加1.5mol/L硫酸溶液10mL沸水浴加热5min，得到水解液.组分鉴定加入0.04mol/LNaOH溶液45ml摇匀沸水浴加热30min（时常搅拌），冷却离心（3000r/min）15min倾入25ml酸性（乙酸）乙醇溶液中（边

4、搅拌边缓缓倾入）Ph5-6，静置，核糖核酸完全沉淀离心（3000r/min）3min磷酸与定磷试剂反应呈蓝色(1ml$+1ml定磷试剂→水浴加热)②核糖与苔黑酚—FeCl3试剂呈鲜绿色(1ml$+2ml苔黑酚—FeCl3试剂→水浴加热)③嘌呤碱与硝酸银作用产生絮状白色的嘌呤银化合物(2ml$+2ml过量氨水+0.1mol/LAgNO31ml)。组份鉴定五、实验结果与分析1、提取的RNA量；2、RNA组份鉴定结果.分析：