实验六_PCR扩增技术

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1、实验六、PCR扩增技术（8学时）1.Taq酶的特点和作用原理2.PCR体系的组成及其作用3.PCR仪器的使用4.PCR反应的设置5.PCR结果的电泳检测时间安排1、介绍PCR扩增技术的原理2、转化子的菌落PCR筛选（此两步共4学时）3、PCR结果的电泳检测4、转化子的酶切鉴定（此两步共4学时）PCR的定义：在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组DNA序列进行的体外扩增反应。PCR的技术特点：特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。他原本是要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足

2、够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA的想法…...很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖，Mullis是其中之一Mullis的第一个PCR实验1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。PCR的发展史1983年春，Mullis发展出PCR的概念；1983年9月，Mullis用

3、大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49bp长度的第一个PCR片断；1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202），这回Mullis是第一发明人。1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法；1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，TaqDNApolymera

4、se，这是85年春天Mullis建议做的；1988年，第一台PCR仪问世；1991年，HoffmanLaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。PCR技术原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。分为三个基本步骤：模板DNA变性：加热至94℃左右，双链DNA解离成单链；模板DNA与引物的退火(复性)：将温度降至引物的Tm值以下(50℃左右)，3‘端与5’端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域通过氢键配对结合；引物的延伸：在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新

5、的双链；重复循环变性--退火--延伸三过程，使DNA扩增量呈指数上升。PCR的原理标准PCR反应体系10×扩增缓冲液10μl4种dNTP混合物各200μmol/L引物10～100pmol模板DNA0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5u（Mg2+）1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）引物引物是PCR特异性反应的关键PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度引物包括正向（F）和反向（R

6、）引物引物设计的原则1、引物长度：16-30个碱基，常为20个碱基左右。2、引物碱基组成：G+C含量以40-60%为宜,ATGC最好随机分布，尤其在3‘端不应存在连续3个G或C,否则会使引物与核酸的G或C富集区错误互补，而影响PCR的特异性。可按下式粗略估计引物的解链温度：Tm＝4(G+C)+2(A+T)。4、避免引物内或引物间出现二级结构或引物间互补避免两引物间互补，特别是3`端5、引物3`端的碱基要求严格配对引物3'端是引发延伸的点。因此不应错配。由于ATCG引起错配有一定规律，以引物3'端A影响最大，因此，尽量避免在引物3'端第一位碱基是A。引物3'端也不要是编码密码

7、子的第三个碱基，以免因为密码子第3位简并性而影响扩增特异性。6、引物5‘端对扩增特异性影响不大,引物中可以加上合适的酶切位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等7、引物的特异性所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特异性扩增,影响产量。引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70％或有连续8个互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。8、两引物的Tm值接近9、简并引物应选用简并程度低的密码子例如选用只有一种密码子的Met,3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。dNTP的质量与浓度dNTP使用注意：1)保存