南方红豆杉水提物联合吉非替尼抑制人非小细胞肺癌细胞系增殖及对相应靶点作用机制的研究

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1、临床医学硕士专业学位硕士学位论文论文题目：南方红豆杉水提物联合吉非替尼抑制人非小细胞肺癌细胞系增殖及对相应靶点作用机制的研究提交日期2014年5月目录中文摘要IIIABSTRACT前言错误!未定义书签。一、材料与方法3（-）实验材料31•实验室32.实验细胞33.实验仪器34.实验药品45.实验试剂46.主要试剂的配置5（-）实验方法81•实验药物的制备82.人肺癌细胞株的复苏、冻存、计数、培养与传代93.MTT法检测南方红豆杉水提物联合吉非替尼对人肺腺癌各细胞株增殖的影响。104.Real-timePCR法检测125・Westernblot检jj®]146.统计学处理17

2、二、实验结果18（-）南方红豆杉水提物和吉非替尼对5种人肺癌细胞增殖抑制的作用18（二）Real-timeRT-PCR方法检测EGFR、ERK1/2、STAT3mRNA表达的影响…25（三）Western-blot法检测南方红豆杉水提物联合吉菲替尼对人肺癌细胞株EGFR、ERK1/2、STAT3等蛋白表达的影响27三、分析与讨论33（一）南方红豆杉抗肿瘤的研究33（二）南方红豆杉对肿瘤细胞增殖的抑制作用34（三）南方红豆杉水提物抗肿瘤信号传导通路的研究分析34（四）工作展望37四、小结38结论38参考文献39附图43致谢51文献综述52中文摘要南方红豆杉水提物联合吉非替尼抑

3、制人非小细胞肺癌细胞系增殖及对相应靶点作用机制的研究目的观察南方红豆杉水提物联合吉非替尼对人肺癌细胞系增殖抑制的作用及对ERK1/2、STAT3信号通路的影响，明确南方红豆杉水提物克服吉非替尼耐药的机制。方法采用水煎剂方式提取南方红豆杉，体外培养的人肺癌细胞株A549、H1975、H820、PC9及其子细胞PC9/R,随机分成空白、南方红豆杉水提物、吉非替尼及南方红豆杉水提物联合吉非替尼组，药物作用细胞后，以MTT法检测各组0D值，计算抑制率及两药合用指数。应用Real-timePCR检测表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR

4、）、ERK1/2、STAT3mRNA表达水平。免疫印迹法（Westenvblotting）检测EGFR、ERK1/2.STAT3、p・STAT3、p・EGFR、p-ERKl/2蛋白表达水平。各组间差别的单因素方差分析用SPSS19.0软件处理。结果1.MTT检测法：南方红豆杉水提物及吉非替尼对人肺癌细胞株A549、H1975、H820、PC9及其子细胞PC9/R增殖抑制明显，处理72h后OD值与对照组比较存在显著性差异（PV0.01）,且各肿瘤细胞株的半数抑制率（IC50）有差别，表明各肿瘤细胞对药物皱感性存在差异。其屮PC9/R、H1975、H820>A549的IC50值

5、明显大于PC9细胞，得出PC9/R、H1975、H820.A549细胞株为吉非替尼耐药细胞株，PC9细胞为敏感细胞株。用0.25mg/ml浓度的南方红豆杉水提物联合不同浓度的吉非替尼（其屮PC9R、A549、H1975、H820细胞株吉非替尼浓度分别为1、3、6、9、12、15、18、30pmol/L,PC9细胞吉非替尼浓度分别为0.010.02>0.04>0.1、0.5、1、5、10pmol/L）作用于不同细胞，均呈现出较单药更为显著的细胞增殖抑制作用（与吉非替尼单药相比，R0.05）,表明两药具有协同作用，但是当联合组中吉非替尼浓度继续增高时，药物杀伤力并未明显升高。2

6、.Real-timePCR检测法：与吉非替尼组相比，5种细胞株联合组中的EGFRmRNA表达均有下调（PvO.05）,PC9/R细胞株联合组中的STAT3mRNA表达下调（P<0.05）,A549、PC9、PC9/R细胞株联合组ERK1/2mRNA表达轻度下调（P<0.05）；H1975、H820、PC9、A549细胞株的STAT3mRNA,H820、Hl975细胞株的ERK1/2mRNA在联合组中无明显变化。与对照组相比，5种细胞的EGFR、STAT3、ERK1/2mRNA表达均降低(PvO.05)。3.Western-blotting检测法：与吉非替尼组相比,A549、

7、H1975、H820、PC9、PC9/R细胞株联合用药组P-STAT3表达均有一定程度的下调(PvO.O5),STAT3蛋白表达变化则无统计学差异；5种细胞株的p-EGFR蛋白表达在联合组中有明显下调(PvO.05),H1975、H820、PC9/R细胞株的EGFR蛋白在联合组中轻度降低，A549、PC9细胞株的EGFR无明显变化；H1975、H820、PC9/R、A549细胞株的p-ERKl/2蛋白在联合组中有一定程度下调(PvO.05),PC9细胞株的p-ERK1/2变化无统计学差异。结论1.南方红豆杉水提物和