健脾理气方联合吉非替尼对hepg2细胞的抑制作用及机制研究

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1、广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名撒同期：纠￥年多月弓。日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保尉使J{j学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电jf版，允许被查阅和借阅。本人授权广州中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，

2、可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名璺毙美论文导师签名同期：厶f髟年夕户J；。同摘要目的：采用人肝癌细胞HepG2进行体外培养实验，观察健脾理气方(Jianpiliqifang，JPLQF)及其有效成分熊果酸(ursolicacid，UA)联合吉非替尼(gefitinib，G)对人肝癌细胞HepG2的生长抑制作用，探讨联合抗肿瘤增敏机制。方法：选取人肝癌细胞HepG2作为研究对象，接种在含10％胎牛血清、1％的青链霉素双抗的DMEM中，置37。C、5％C02、相对湿度90％的培养箱中培养，每3’4d传代1次。取对数生长期的HepG2

3、细胞种板，培养24h后加药。实验分成以下各组：OJPLQF2、4、6、8、10、15、20mg／mL不同剂量组；②G20uM组；@JPLQF+G联合用药组；④空白组；⑤对照组；⑥uA5、15、20、25、30uM；⑦UA+G联合用药组，各组相应试剂处理后继续培养，进行以下实验：MTT法测定各组对细胞增殖的影响；Hoechst33258染色法于荧光显微镜观察细胞形态学变化；流式细胞仪检测细胞凋亡情况；WesternBlotting检测DNMTl和EZH2蛋白表达的情况及对AMPKQ和EGFR激酶磷酸化表达的影响。结果：1．健脾理气方及其有效成分熊果酸联合吉非替尼对人肝癌细胞HepG2增殖的影响不

4、同浓度健脾理气方及其有效成分熊果酸对人肝癌细胞HepG2均具有显著的抑制增殖作用，且随药物浓度增大和作用时间的延长而增强，呈时间和剂量依赖关系。健脾理气方或熊果酸分别联合吉非替尼后，细胞增殖抑制率高于单独用药组，具有相加效应。2．健脾理气方及其有效成分熊果酸联合吉非替尼对人肝癌细胞HepG2凋亡的影响健脾理气方、熊果酸、吉非替尼、健脾理气方或熊果酸分别联合吉非替尼作用于人肝癌细胞HepG224h后，经Hoechst33258染色，荧光显微镜下可观察到肝癌细胞出现典型凋亡形态学变化，以联合作用时变化更明显。流式细胞仪检测发现健脾理气方和熊果酸能引起HepG2细胞早期凋亡，且具有一定的剂量依赖性。

5、联合用药早期凋亡率升高，其促凋亡作用高于单独用药组。3．健脾理气方及其有效成分熊果酸联合吉非替尼对人肝癌细胞HepG2DNMTl和EZH2蛋白表达及相关激酶的影响健脾理气方、熊果酸、吉非替尼及健脾理气方或熊果酸联合吉非替尼作用人肝癌细胞HepG224h后，均能下调DNMTl及EZH2蛋白的表达水平，且两药联用DNMTl及EZH2蛋白的表达水平下调更明显。初步研究结果显示，健脾理气方lOmg／mL或熊果酸20uM作用能增力IAMPKQ激酶磷酸化、减少EGFR激酶磷酸化。结论：1．健脾理气方、熊果酸、吉非替尼及健脾理气方或熊果酸联合吉非替尼均能抑制人肝癌细胞HepG2增殖，且联用的增殖抑制效果更强

6、，具有相加效应。2．健脾理气方、熊果酸、吉非替尼及健脾理气方或熊果酸联合吉非替尼对人肝癌细胞株HepG2均具有诱导细胞凋亡作用，且联用后促凋亡效果更强。3．健脾理气方、熊果酸、吉非替尼及健脾理气方或熊果酸与吉非替尼分别联用能下调人肝癌细胞株HepG2DNMTl及EZH2蛋白表达水平，以联合作用较明显。4．健脾理气方lOmg／mL或熊果酸20uM具有增力IIAMPKQ激酶磷酸化、减少EGFR激酶磷酸化的作用。关键词：健脾理气方；熊果酸；吉非替尼；联合作用；增敏机制StudythemechanismsofcombineddianPiIiqidecoctionwithGelitinibininhib

7、itionofhumanIivercancerceIgrowthSpeciaIty：Author：YeTraditionaIChineseMediCineYing“。YTutor：DengShi—GuiAbstractObjectiveUsinghumanlivercancercellHepG2invitroexperiment，wewanttodetectthegrowthinhibitione