紫花牡荆素诱导结肠癌干细胞样细胞凋亡作用的分析

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1、紫花牡荆素诱导结肠癌干细胞样细胞凋亡作用的研究硕丄研究牛黄丽萍导师曾斌中文摘要目的研究多甲氧基黄酮即紫花牡荆素(casticin,CAS)诱导源自人结肠癌HCT116细胞系肿瘤球形成细胞即结肠癌干细胞样细胞(coloncancerstemcelllikecells,CCSLCs)凋亡作用。探讨CAS诱导CCSLCs凋亡是否涉及其降低细胞Akt蛋口磷酸化水平作用。方法体外培养人结肠癌HCT・116细胞，干细胞条件培养基成球培养法分离和富集CCSLCs为受试对彖。采用肿瘤球形成法检测不同浓度CAS对CCSLCs自我更

2、新的影响。碘化丙噪(propidiumiodide,PI)染色流式细胞术(flowcytometry,FCM)定量分析CAS对CCSLCs细胞凋亡率的影响。DNA琼脂糖凝胶电泳观察CAS对CCSLCs细胞DNA核小体间断裂的影响。荧光标记CD133抗体FCM分析CAS对CCSLCs干细胞标志物CD133表达的影响。最后，采用WesternBlot分析CAS对CCSLCs细胞Akt蛋白磷酸化水平的影响。结果体外培养和扩增人结肠癌HCT116细胞系细胞，采用干细胞条件培养基悬浮培养10天，细胞呈典型非粘附三维结肠癌肿

3、瘤球体生长。肿瘤球形成法检测结果显示，在5.0〜10.0gM浓度范围内，CAS以浓度依赖方式减少CCSLCs的肿瘤球数n(P<0.05)oPI染色FCM分析结果表明CAS(5.0和10.0

4、iM)增加CCSLCs凋亡率，呈浓度依赖趋势(PV0.05)。CAS(5.0和lO.OpM)处理CCSLCs24小时，DNA琼脂糖凝胶电泳呈现核小体间DNA断裂的梯形条带图谱。荧光标记CD133抗体FCM分析结果发现CAS以浓度依赖方式降低干细胞标志蛋白CD133表达(PV0.05)。WesternBlot检测提示CAS抑制C

5、CSLCs细胞Akt蛋口磷酸化，成浓度依赖性(PV0.05)。结论1.CAS具有抑制CCSLCs自我更新及诱导CCSLCs凋亡作用。2.CAS可能通过抑制细胞Akt蛋白磷酸化进而抑制CCSLCs的肿瘤干细胞特性。关键词结肠癌；结肠癌干细胞样细胞；紫花牡荆素；细胞凋亡；H我更新InvestigationofapoptoticeffectinducedbycasticinincoloncancerstemlikecellsAbstractObjectiveTheobjectiveofthisstudywastoinv

6、estigatewhethercasticin,apolymethoxyflavone,inducesapoptoticcelldeathofthesphereformingcellsderivedfromhumancoloncancercelllineHCT-116culturedinvitro,namelycoloncancerstemcelllikecells(CCSLCs),andtoexplorewhetherthiseffectofcasticinisinvolvedinadecreaseofthel

7、evelofAktproteinphosphorylationinCCSLCs.MethodsHumancoloncancerHCT-116celllinewasculturedinvitro.ThestemcellconditionedculturesystemwasusedtoisolateandenrichCCSLCsthatwasusedasthetestedobject.Theself^renewalwasassessedusingtumorsphereformationassayfollowingex

8、posureofCCSLCstovariousconcentrationsofcasticin.ApoptoticrateofCCSLCsindycedbycasticinwasanalyzedbyflowcytometry(FCM)usingpropidiumiodide(PI)staining.TheapoptoticeffectofcasticininCCSLCswascertifiedbyDNAagarosegelelectrophoresis,theexpressionlevelsofCD133asas

9、temcellrelatedproteinintheHCT・116sphere・fbrmingcellswasdeterminedusingFCManalysiswithFITC-antibodyagainstCD133.Finally,theexpressionofAktproteinphosphorylationinCCSLCswasexaminedbywestern